急性肝衰竭小鼠腸黏膜通透性變化機制及微生態(tài)制劑的保護作用.pdf

1、目的:肝衰竭是指由多種因素引起的嚴重肝臟損害，導致肝臟本身合成、解毒、排泄和生物轉化等功能發(fā)生嚴重障礙或失代償，臨床上出現(xiàn)以凝血機制障礙、黃疸、肝性腦病、腹水等為主要表現(xiàn)的一組癥候群[1]。關于肝衰竭的發(fā)病機理目前尚不十分清楚。近年來，多數(shù)學者認為本病的發(fā)生主要是免疫損傷，缺血缺氧，內(nèi)毒素血癥三重致死性打擊的結果[2]。肝衰竭時存在嚴重的內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素及其下游產(chǎn)物腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TN

2、F-α)、白介素-6、NO等炎性細胞因子的異常升高，一方面可以導致大量肝細胞壞死或凋亡，亦能通過某種機制影響或是破壞了腸黏膜屏障功能，導致腸黏膜通透性增高，從而使得一些大分子物質、細菌及其毒素均可以隨意通過腸黏膜屏障，并且與自發(fā)性細菌性腹膜炎、肝性腦病等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生密切相關。因此本實驗擬通過對BALB/c小鼠腹腔注射D-氨基半乳糖建立急性肝衰竭小鼠(acute liverfailure，ALF)模型，并應用微生態(tài)制劑—雙歧桿菌乳桿菌

3、三聯(lián)活菌（金雙歧）灌胃干預，研究急性肝衰竭小鼠回腸ZO-1蛋白表達情況及其與血清TNF-α、血漿內(nèi)毒素水平等的關系，以探討ALF腸黏膜通透性升高的可能機制以及微生態(tài)制劑的保護作用。
　　方法:選用健康清潔級6-8周齡雄性BALB/c小鼠30只，體重18-22g。30只小鼠采用隨機數(shù)字表法分成正常對照組、急性肝衰竭組和金雙歧干預組（簡稱干預組），每組各10只。所有小鼠均標準飼料喂養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度18-22℃，相對濕度(60.0±10.0

4、)％。正常對照組及急性肝衰竭組小鼠給予生理鹽水（9ml/kg/d）灌胃，干預組給予雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌（900mg/kg/d，生理鹽水配成100mg/ml混懸液）灌胃，每日一次，兩周后急性肝衰竭組和干預組一次性腹腔注射D-氨基半乳糖（3.0g/kg，以生理鹽水溶解，濃度為60mg/ml），正常對照組腹腔注射等體積生理鹽水。注射后9h以10％水合氯醛腹腔注射麻醉，摘眼球法處死小鼠，留取血清、血漿、肝組織及回腸組織。應用日本OLYMPUS

5、 AU-2700全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)，天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）;酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清TNF-α水平;應用鱟試劑顯色基質法測定血漿內(nèi)毒素水平;取部分肝組織固定于10％福爾馬林溶液，石蠟包埋，4μm連續(xù)切片并進行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察肝組織的普通病理學改變;實時

6、熒光定量聚合酶鏈反應(real time quantitative polymerase chainreaction，RT-qPCR)檢測肝組織TNF-α mRNA及回腸組織ZO-1 mRNA的表達;Western blot檢測回腸ZO-1蛋白的表達。采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（(x)±s）表示。數(shù)據(jù)分析前進行正態(tài)性及方差齊性檢驗。滿足正態(tài)且方差齊時，采用單因素方差分析，組間比較采用Student

7、-Newman-Keuls法。非正態(tài)或方差不齊時，采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。相關性分析采用Pearson直線相關分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1小鼠的一般情況
　　正常對照組小鼠毛發(fā)有光澤，精神狀態(tài)好，飲食量多，對外界刺激反應靈敏;急性肝衰竭組小鼠毛發(fā)凌亂沒有光澤，飲食量明顯減少，活動減少，對外界刺激反應遲鈍;干預組小鼠上述表

8、現(xiàn)介于正常對照組與急性肝衰竭組之間。
　　2肝組織病理學變化
　　HE染色示:正常對照組:肝小葉結構清晰，以中央靜脈為軸，肝細胞索呈放射狀排列，肝細胞結構完整，大小均勻，無變性及壞死，無炎細胞浸潤;急性肝衰竭組:肝小葉結構紊亂，肝細胞索消失，可見多處出血壞死灶，并有大量炎細胞浸潤;干預組:肝小葉結構基本完整，細胞排列較整齊，僅見輕度細胞水腫，小葉中央?yún)^(qū)僅有少量點狀壞死，變性、壞死及炎性細胞浸潤的程度均較急性肝衰竭組顯著改善。

9、
　　3各組小鼠血清ALT、AST、TNF-α及血漿內(nèi)毒素水平變化
　　急性肝衰竭組小鼠血清ALT（393.587±31.010）、AST(475.751±41.536)、TNF-α(435.971±30.415)及血漿內(nèi)毒素（3.789±0.313）水平均高于正常對照組（38.994±9.628、55.279±7.500、51.602±8.540、0.577±0.120），差異具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）;干預組上述

10、各指標(158.271±23.637、259.216±22.492、256.289±26.221、2.716±0.214)均較急性肝衰竭組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P值均＜0.01）。
　　4肝組織TNF-α mRNA及回腸組織ZO-1 mRNA表達變化
　　急性肝衰竭組小鼠肝組織TNF-α mRNA表達（3.355±0.274）明顯高于正常對照組(1.00)，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);并且，干預組小鼠肝組織T

11、NF-α mRNA表達(2.284±0.212)較急性肝衰竭組明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　急性肝衰竭組小鼠回腸ZO-1 mRNA表達(0.441±0.046)明顯低于正常對照組(1.00)，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;干預組小鼠回腸ZO-1mRNA表達（0.680±0.039）較急性肝衰竭組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　5回腸組織ZO-1蛋白水平
　　急性肝衰竭組小

12、鼠回腸ZO-1蛋白表達(0.361±0.037)明顯低于正常對照組（0.808±0.069），差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);干預組小鼠回腸ZO-1蛋白表達（0.552±0.055）較急性肝衰竭組明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　6 ZO-1蛋白與血清TNF-α、血漿內(nèi)毒素水平的相關性分析
　　各組小鼠回腸ZO-1蛋白的表達與血清TNF-α、血漿內(nèi)毒素水平均呈負相關，相關系數(shù)分別為r=-0.946，-0

13、.919（P值均＜0.01）。
　　結論:
　　1腹腔注射D-氨基半乳糖能夠成功建立急性肝衰竭小鼠模型，血清TNF-α和血漿內(nèi)毒素在其發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮不可或缺的作用。
　　2急性肝衰竭小鼠回腸ZO-1 mRNA/蛋白表達較正常對照組明顯下降，且ZO-1蛋白的表達量與血清TNF-α水平之間存在相關性，TNF-α通過抑制回腸ZO-1 mRNA的表達進而下調(diào)ZO-1蛋白的表達，破壞腸黏膜上皮細胞間的緊密連接，可能是TNF-α導