NASH小鼠腸黏膜屏障的變化及布拉氏酵母菌對(duì)其作用機(jī)制的初步探討.pdf

1、近年來，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）逐漸成為歐美發(fā)達(dá)國家最主要肝病。流行病學(xué)研究表明，在世界范圍內(nèi)有10％-50％的人群肝臟出現(xiàn)脂肪變性[1]。其中一部分患者會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化，有的甚至最終發(fā)展為肝硬化、肝細(xì)胞癌[2]。據(jù)預(yù)測，僅需10年左右的時(shí)間，NAFLD將有可能成為終末

2、期肝病和肝移植的首要病因。在過去的20年里，盡管對(duì)于NAFLD患病率和死亡率的結(jié)果仍存在爭議[3]，現(xiàn)在公認(rèn)它是引起非酒精性肝硬化（之前常常被認(rèn)為由不明原因引起）的主要原因[4]。NAFLD是一種慢性肝病，常表現(xiàn)為一系列代謝綜合征，如肥胖、高血糖、高血壓、血脂異常、高尿酸、高脂肪肝發(fā)生率和高胰島素血癥等[5-8]。目前認(rèn)為其病理生理機(jī)制系多因素參與，但仍尚不明確。
　　越來越多的證據(jù)表明，腸-肝軸功能失調(diào)是NAFLD發(fā)生發(fā)展的一個(gè)

3、重要因素。小腸細(xì)菌過度生長、腸道功能失調(diào)、腸黏膜通透性增加等都與NAFLD有著重要聯(lián)系。正常情況下機(jī)體腸道每天會(huì)接觸大量的細(xì)菌和內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)，完整的腸黏膜屏障可以阻止其進(jìn)入機(jī)體。當(dāng)腸道菌群紊亂、腸黏膜屏障功能受損，腸道通透性增加，細(xì)菌可以透過腸黏膜屏障，發(fā)生移位進(jìn)入血液循環(huán)，形成腸源性內(nèi)毒素血癥。再通過激活肝臟枯否細(xì)胞，介導(dǎo)LPS-CD14-TLR4信號(hào)通路發(fā)揮作用。LPS不僅可以直接損害肝臟，

4、而且可以誘導(dǎo)大量TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而放大內(nèi)毒素的作用，進(jìn)一步加重肝臟和腸黏膜損傷，形成惡性循環(huán)。腸黏膜屏障功能在腸-肝軸中起了至關(guān)重要的作用。
　　人體腸道內(nèi)含有大量微生物，一些細(xì)菌微生物與人體形成共生關(guān)系。益生菌常常被定義為活的微生物，適當(dāng)攝入對(duì)健康有益。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌不僅可以預(yù)防和治療多種胃腸道疾病，而且對(duì)不同原因?qū)е碌母闻K疾病也產(chǎn)生有益影響。近年來研究者們針對(duì)益生菌通過腸-肝軸發(fā)揮有利作用的

5、機(jī)制進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)可能與調(diào)節(jié)腸道微生物組成和抑菌因子的分泌、改善腸上皮的通透性、調(diào)節(jié)局部及全身免疫功能等方面有關(guān)，但其確切的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。布拉氏酵母菌(Saccharomyces boulardii)是目前臨床上使用的唯一的真菌類益生菌制劑，口服后不會(huì)被胃酸、膽汁和抗生素破壞，并能夠通過分泌一些短肽蛋白中和、降解細(xì)菌毒素，對(duì)腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用。
　　目的:建立高脂飲食的NASH小鼠動(dòng)物模型，檢測小鼠內(nèi)毒素水平，腸

6、黏膜屏障變化情況，初步探討腸黏膜屏障在非酒精脂肪性肝病發(fā)病中的作用機(jī)制;予布拉氏酵母菌散劑灌胃進(jìn)行干預(yù)，觀察通過改善腸道菌群，降低內(nèi)毒素血癥后，其腸黏膜屏障和炎癥的變化，初步探討該藥物在NASH中可能的治療作用及其相關(guān)作用機(jī)制。
　　方法:①動(dòng)物模型的制備:將6-8周齡的C57BL/6雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱重標(biāo)記，應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NG，n=16)、模型組(MG，n=22)。NG組給予普通對(duì)照飲食、MG組給予高

7、脂飲食。于33周末隨機(jī)處死各組5只動(dòng)物，進(jìn)行肝臟H&E染色，組織病理學(xué)改變，證實(shí)了NASH模型成功。造模成功后從MG組隨機(jī)選出12只小鼠，再隨機(jī)分為布拉氏酵母菌灌胃組(TB，n=6)和灌胃對(duì)照組(TD，n=6)，予高脂飲食。同時(shí)繼續(xù)飼養(yǎng)正常對(duì)照組和模型組剩余小鼠。TB組開始給予布拉氏酵母菌灌胃，按照460mg/kg灌胃，每只小鼠灌胃量為0.5ml，每天1次[9]。TD組同時(shí)開始給予布拉氏酵母菌相應(yīng)輔料（果糖、乳糖）溶解于等量生理鹽水灌胃

8、，為期8周治療，隨后處死所有小鼠。②觀察小鼠的毛色、活動(dòng)、進(jìn)食、飲水和排便等情況，同時(shí)每周定時(shí)測定小鼠體重，根據(jù)體重變化調(diào)節(jié)灌胃劑量。③處死小鼠后，觀察回腸及肝臟情況，留取末端回腸及肝臟組織，稱肝臟濕重。④應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT），谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和甘油三酯(TG)水平的測定;采用鱟試劑法測定血清內(nèi)毒素水平。⑤H&E染色觀察肝臟組織及末端回腸黏膜病理改變。⑥采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測Occludin蛋白、I

9、L-17在各組小鼠回腸末端組織的表達(dá)情況。⑦采用Real-time Q-PCR(Real-timequantitation PCR)方法檢測各組小鼠回腸組織中Occludin、IL-17A、TNF-α、RORγtmRNA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1、各組小鼠體重、肝重指數(shù)變化
　　于33周末對(duì)部分小鼠處死，肝組織H&E染色，證實(shí)小鼠NASH模型復(fù)制成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組體重、肝重指數(shù)進(jìn)行比較，33周末時(shí)，MG組均

10、較NG組顯著增高（體重:42.00±3.13 g vs.28.92±2.62 g，P＜0.05;肝重指數(shù):8.32±0.68 vs.5.20±0.42, P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌胃干預(yù)治療后，TB組分別與MG組、TD組比較均降低（體重:36.02±1.29g vs.42.00±3.13 g,P＜0.05;36.02±1.29 gvs.40.04±2.51 g,P＜0.05;肝重指數(shù):7.24±0.51 vs.8.32±0.6

11、8, P＜0.05;7.24±0.51 vs.8.22±0.70, P＜0.05),但仍高于NG組（體重:36.02±1.29 g vs.28.92±2.62 g，P＜0.05;肝重指數(shù):7.24±0.51 vs.5.20±0.42, P＜0.05），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;TD組與MG組比較均無明顯變化（體重:40.04±2.51 g vs.42.00±3.13 g，P＞0.05;肝重指數(shù)8.22±0.70 vs.8.32±0.68,P＞0.0

12、5）。說明應(yīng)用布拉氏酵母菌對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠干預(yù)治療后，小鼠體重會(huì)下降;而灌胃對(duì)照較前無明顯變化。
　　2、血清生化指標(biāo)變化
　　①與NG組相比，MG組血清ALT、 AST和TG顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ALT:146.89±7.67 U/L vs.24.41±5.56 U/L, P＜0.05; AST:124.96±8.79 U/L vs.53.94±6.34 U/L, P＜0.05; TG:0.80±0.07

13、 mmol/L vs.0.35±0.08 mmol/L, P＜0.05);TB組血清ALT、 AST及TG升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ALT:65.70±4.15 U/L vs.24.41±5.56 U/L, P＜0.05;AST:110.18±7.19 U/L vs.53.94±6.34 U/L, P＜0.05; TG:0.50±0.03 mmol/L vs.0.35±0.08 mmol/L, P＜0.05);TD組顯著升高（ALT:142.

14、66±8.24 U/L vs.24.41±5.56 U/L, P＜0.05; AST:125.64±0.76 U/L vs.53.94±6.34 U/L, P＜0.05;TG:0.76±0.07 mmol/L vs.0.35±0.08 mmol/L, P＜0.05）;②與MG組相比，TB組ALT、 AST及TG顯著降低（ALT:65.70±4.15U/Lvs.146.89±7.67U/L, P＜0.05; AST:110.18±7.19

15、 U/L vs.124.96±8.79 U/L, P＜0.05; TG:0.50±0.03 mmol/L vs.0.80±0.07 mmol/L, P＜0.05）;TD組無明顯變化（ALT:142.66±8.24 U/L vs.146.89±7.67 U/L, P＞0.05; AST:125.64±0.76 U/L vs.124.96±8.79 U/L, P＞0.05; TG:0.76±0.07 mmol/L vs.0.80±0.07

16、mmol/L,P＞0.05）;③與TD組相比，TB組ALT、 AST及TG顯著降低(ALT:65.70±4.15 U/L vs.142.66±8.24 U/L, P＜0.05; AST:110.18±7.19 U/L vs.125.64±0.76 U/L, P＜0.05; TG:0.50±0.03 mmol/L vs.0.76±0.07 mmol/L,P＜0.05）。
　　3、血清LPS水平比較
　　MG組與NG組相比，血清

17、LPS顯著升高（0.289±0.031 EU/ml vs.0.158±0.005 EU/ml，P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。灌胃干預(yù)治療后:①TB組血清LPS分別與MG組、TD組相比均降低（0.200±0.029 EU/mlvs.0.289±0.031EU/ml,P＜0.05;0.200±0.029 EU/ml vs.0.288±0.031EU/ml,P＜0.05）;但仍比NG組高(0.200±0.029 EU/ml vs.0.15

18、8±0.005 EU/ml，P＜0.05)。②TD組與MG組血清LPS無明顯變化(0.288±0.031EU/ml vs.0.289±0.031 EU/ml, P＞0.05)。
　　4、肝臟病理變化
　　肉眼觀:NG組小鼠肝臟色澤鮮亮，紅褐色，邊緣銳利，質(zhì)地柔軟，富有彈性。MG組小鼠肝臟體積彌漫性增大，色澤蒼白或帶灰黃色，表面光滑，有油膩感，邊緣厚而鈍，切面呈淡黃或黃紅色，欠光澤，刀面脂肪沾染，質(zhì)稍硬。TB組小鼠肝臟偏黃，質(zhì)

19、地中等，但與NG組比較顏色仍發(fā)淺。TD組與MG組無明顯變化。
　　光鏡下:NG組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完整，可見圍繞中央靜脈呈放射狀排列的肝細(xì)胞索，肝細(xì)胞體積正常，界限清楚，中央可見大而圓的細(xì)胞核，胞漿均勻，無脂肪變性及炎性細(xì)胞浸潤。MG組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)均可見充滿大量脂肪滴，肝細(xì)胞氣球樣變，可見到程度不等的小葉區(qū)或匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤、點(diǎn)狀壞死。灌胃干預(yù)治療后，TB組肝臟中央靜脈的四周肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚存在，在遠(yuǎn)離中央靜脈的肝細(xì)胞尚有輕度脂肪變性

20、，可見炎癥細(xì)胞浸潤減少，與MG組相比，脂肪變性、炎癥程度都減輕，但與正常肝臟仍存在差距;TD組與灌胃前后無明顯變化。
　　5、回腸病理變化
　　NG組小鼠末端回腸黏膜各層結(jié)構(gòu)基本完整，絨毛排列有序、整齊，不疏松，上皮細(xì)胞形態(tài)正常，呈高柱狀，未見明顯黏膜充血水腫，腸腺排列整齊，固有層未見炎性細(xì)胞浸潤;MG組小鼠末端回腸小腸絨毛稍疏松，部分萎縮，斷裂缺損，高矮不一。上皮細(xì)胞緊密連接間隙增寬，黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落，上皮層與固有層分

21、離，部分可見水腫和炎性細(xì)胞浸潤。應(yīng)用布拉氏酵母菌治療后，TB組腸黏膜損傷情況較MG組減輕。TD組與MG組無明顯改變。
　　6、Occludin蛋白、IL-17在小鼠回腸末端組織的表達(dá)情況
　　Occludin蛋白表達(dá)情況:NG組Occludin蛋白均勻一致的分布在腸上皮細(xì)胞連接處的頂端，呈線狀分布，呈表達(dá)很強(qiáng)的棕褐色信號(hào);MG組Occludin蛋白陽性染色明顯減弱，連續(xù)性降低，分布不均，較NG組表達(dá)減少。干預(yù)治療后，TB組較

22、MG組Occludin蛋白表達(dá)增強(qiáng)，染色加深，連續(xù)性好轉(zhuǎn)。TD組與MG組差異不大。IL-17表達(dá)情況:與NG組比較MG組表達(dá)增加，干預(yù)治療后TB組表達(dá)減少，TD組與MG組無明顯變化。
　　7、回腸組織中Occludin、 IL-17A、TNF-α、RORtmRNA的表達(dá)情況
　　回腸組織中Occludin mRNA的表達(dá):MG組與NG組比較表達(dá)減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);TB與MG組比較表達(dá)增加，但仍低于NG組，

23、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);TD組與MG組比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　回腸組織中IL-17A、RORγt、TNF-αmRNA的表達(dá):MG組與NG組比較表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);TB與MG組比較表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);TD組與MG組比較，P＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　1、高脂飲食可以成功建立小鼠NASH模型，NASH小鼠存在腸源性內(nèi)毒素血癥。