小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞在急性肝衰竭中的作用.pdf

1、急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是由多種因素引起的大量肝細(xì)胞壞死，肝臟生理功能短時(shí)間內(nèi)遭到嚴(yán)重?fù)p害，出現(xiàn)以嚴(yán)重消化道癥狀、凝血障礙、黃疸及不同程度的腹水和肝性腦病等為主要臨床表現(xiàn)的綜合征。其臨床癥狀危重，預(yù)后極差，內(nèi)科綜合治療效果不佳，死亡率較高。目前研究表明直接損傷和免疫損傷是肝衰竭重要的發(fā)病機(jī)制，免疫系統(tǒng)過度活化是急性肝衰竭發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。
　　樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DC)是體

2、內(nèi)功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，能直接活化靜息T淋巴細(xì)胞，是溝通原始免疫和獲得性免疫的橋梁，目前在腫瘤的免疫治療方面具有較好的臨床實(shí)踐。調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞(regulatory dendritic cells，DCregs)是一類具有負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能的DC，可誘導(dǎo)T細(xì)胞低反應(yīng)性，介導(dǎo)免疫耐受。
　　基于急性肝衰竭的免疫機(jī)制和DCregs的功能特性，設(shè)想將DCregs用于治療急

3、性肝衰竭，探究其在免疫調(diào)節(jié)中的作用和在肝衰竭治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值。
　　在本研究中，通過兩部分實(shí)驗(yàn)對小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞的生物學(xué)特性及其在急性肝衰竭中的作用機(jī)制作了初步探討。
　　一、小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定
　　目的：體外誘導(dǎo)小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞的生成，檢測其生物學(xué)特性，探討其發(fā)揮免疫作用的機(jī)制
　　方法：1、分離、提純小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分為A、B、C三組置于完全培養(yǎng)基（R

4、PMI-1640加10％胎牛血清）體外培養(yǎng);
　　2、培養(yǎng)過程中A、B組加入GM-CSF+IL-4，C組加入GM-CSF+IL-10+TGF-β，隔天半量換液，培養(yǎng)至第8天，B、C組均給予脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激24h，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)一步分化;
　　3、觀察細(xì)胞生長情況，檢測細(xì)胞表面標(biāo)志物水平，與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)檢測其對T細(xì)胞增殖、分泌功能的影響;
　　結(jié)果：1、通過細(xì)胞因子體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小

5、鼠骨髓來源細(xì)胞可獲取具有樹突狀結(jié)構(gòu)的細(xì)胞，且B、C組細(xì)胞分叉更多，樹突狀突起更明顯;
　　2、流式細(xì)胞儀檢測顯示B組表達(dá)高水平MHC-Ⅱ、CD80、CD86，分別為(52.21±2.31)％，(78.91±1.57)％，(66.25±2.47)％，呈現(xiàn)成熟樹突狀細(xì)胞(maturedendritic cells，mDC)的特性，A、C組低表達(dá)上述因子，分別為未成熟樹突狀細(xì)胞(imature dendritic cells，iDC)和

6、調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞(DCreg)，A、C組表達(dá)水平為(25.31±1.56)％，(60.21±2.36)％，(39.57±1.45)％和(37.41±1.34)％,(40.57±1.46)％,(28.39±2.73)％;
　　3、刺激T細(xì)胞增殖能力檢測顯示，A、C組細(xì)胞增殖率明顯低于B組，有明顯差異(P＜0.05)，且C組增殖率明顯低于A組，有顯著性意義(P＜0.05);A、C組細(xì)胞可提高IL-10的分泌水平，降低IL-12的分泌，

7、且C組細(xì)胞作用更明顯(P＜0.05)。
　　結(jié)論：通過體外誘導(dǎo)分化成功獲取骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其刺激異基因淋巴細(xì)胞增殖能力較弱，表現(xiàn)低免疫原性，為調(diào)節(jié)免疫炎癥提供理論基礎(chǔ)。
　　二、小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞在急性肝衰竭中作用機(jī)制初步研究
　　目的：建立小鼠急性肝衰竭模型，探討小鼠骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞在急性肝衰竭中的作用及其可能機(jī)制。
　　方法：1、將小鼠隨機(jī)分為三組，空白對照組(control)

8、、急性肝衰竭組(ALF)及調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞治療組(DCregs)。
　　2、ALF組和DCregs組聯(lián)合腹腔注射D-氨基半乳糖(D-galactosamine，D-GalN)和LPS建立急性肝衰竭模型，空白對照組注射等量生理鹽水。DCregs組小鼠在建模后半小時(shí)尾靜脈注射骨髓來源調(diào)節(jié)性樹突狀細(xì)胞（誘導(dǎo)方法同前），空白對照組和ALF組注射等量培養(yǎng)基。
　　3、留置小鼠觀察生存率及其生存狀態(tài)。
　　4、于造模后2h、6h、

9、12h、24h和48h隨機(jī)選取小鼠，留取血標(biāo)本和肝組織，制作肝臟組織HE染色病理切片，檢測血生化和TNF-α、IL-6等細(xì)胞炎癥因子水平及變化，檢測TLR4、NF-κ B(P65)等信號分子的表達(dá)。
　　結(jié)果：1、DCregs觀察組小鼠生存率為60％，明顯高于ALF觀察組30％(P＜0.05);
　　2、ALF組和DCregs組小鼠肝臟組織均有明顯損傷，但DCregs組肝臟組織病變較輕;
　　3、與空白對照組比較，AL

10、F組和DCregs組ALT、AST、TNF-α和IL-6水平均明顯升高(P＜0.05);但DCregs組水平低于ALF組，除2h時(shí)間點(diǎn)外差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); WB和PCR結(jié)果顯示，造模后ALF組和DCregs組TLR4和NF-κB(P65)表達(dá)水平隨造模時(shí)間明顯升高(P＜0.05)，于24h到達(dá)高峰，且DCregs組表達(dá)水平明顯低于ALF組(P＜0.05)。
　　結(jié)論：小鼠尾靜脈注射DCregs可明顯降低急性肝衰竭小