干細(xì)胞片-富含血小板血漿-磷酸鈣顆粒用于骨修復(fù)的研究.pdf

1、背景:
　　 在臨床中因創(chuàng)傷、腫瘤、感染等原因?qū)е碌墓钦垡约肮侨睋p的重建常常需要外科手段的治療。在諸多的治療方法中，自體骨移植仍被認(rèn)為是骨缺損治療的金標(biāo)準(zhǔn)。但是自體骨移植存在一些缺點(diǎn)，例如供區(qū)組織有限，供體部位發(fā)病率，增加患者手術(shù)痛苦與風(fēng)險(xiǎn)等。特別是在針對(duì)大段骨缺損的修復(fù)時(shí)，這些問題顯得尤為突出，這無(wú)疑限制了自體松質(zhì)骨移植技術(shù)在臨床中的應(yīng)用。對(duì)于異體骨移植又存在感染外源疾病和引起免疫反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。近年來(lái)，隨著組織工程研究的興起，嘗

2、試用組織工程的方法來(lái)修復(fù)骨或重建缺損逐漸成為研究的熱點(diǎn)，組織工程是建立在種子細(xì)胞、生長(zhǎng)因子和生物材料支架三要素基礎(chǔ)上的。干細(xì)胞具有多向分化潛能，并且在骨組織工程中廣泛應(yīng)用，而骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞獲取途徑簡(jiǎn)單方便，是良好的種子細(xì)胞，此外研究表明干細(xì)胞在高密度培養(yǎng)后會(huì)形成細(xì)胞片層狀結(jié)構(gòu)，即干細(xì)胞片;生長(zhǎng)因子能誘導(dǎo)干細(xì)胞定向分化，在應(yīng)用中可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)，但是生長(zhǎng)因子價(jià)格昂貴（如BMP-2），尋找能發(fā)揮同生長(zhǎng)因子效應(yīng)的藥物或自體來(lái)源的生

3、長(zhǎng)因子具有深遠(yuǎn)意義，研究表明辛伐他汀可以刺激內(nèi)源性的細(xì)胞分泌BMP-2，而自體來(lái)源的富含血小板血漿(PRP)含有多種生長(zhǎng)因子;對(duì)于生物材料，硫酸鈣由于其優(yōu)良的生物相容性和骨傳導(dǎo)性，磷酸鈣由于其組成與骨組織一致，兩種材料都在骨組織工程中廣泛應(yīng)用，因此在本課題中研究辛伐他汀、PRP對(duì)于細(xì)胞的作用以及MSC細(xì)胞片、載有辛伐他汀的硫酸鈣支架、MSC細(xì)胞片聯(lián)合PRP凝膠/納米磷酸鈣在骨組織工程中的應(yīng)用，從而對(duì)其潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了檢測(cè)和評(píng)估。

4、本課題主要從以下五個(gè)方面進(jìn)行了研究:(1)局部緩慢釋放的辛伐他汀/硫酸鈣支架在尺骨長(zhǎng)段骨缺損再生修復(fù)中的應(yīng)用研究;(2)辛伐他汀對(duì)大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞和細(xì)胞片的增殖、分化的作用;(3)間充質(zhì)干細(xì)胞片移植促進(jìn)骨折愈合的應(yīng)用研究;(4)富含血小板血漿/納米磷酸鈣對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的作用;(5)間充質(zhì)干細(xì)胞片復(fù)合富含血小板血漿凝膠/納米磷酸鈣修復(fù)骨缺損的研究。
　　 第一部分局部緩慢釋放的辛伐他汀/硫酸鈣支架在尺骨長(zhǎng)段骨缺損再生修復(fù)

5、中的應(yīng)用研究
　　 目的:研究辛伐他汀從載有辛伐他汀的硫酸鈣支架的釋放及載有辛伐他汀的硫酸鈣支架促進(jìn)骨組織的再生修復(fù)作用。
　　 方法和結(jié)果:在體外實(shí)驗(yàn)中將0.5mg辛伐他汀與硫酸鈣粉末（16.mg和480mg）混合制作成載有辛伐他汀的硫酸鈣支架，并測(cè)定辛伐他汀的釋放曲線，結(jié)果顯示在第1天辛伐他汀能有效的較大量的從硫酸鈣支架中釋放，隨著時(shí)間持續(xù)能穩(wěn)定的釋放。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):36個(gè)完整的1.2厘米的兔尺骨骨缺損分別植入硫酸鈣

6、支架、載有辛伐他汀的硫酸鈣支架和載有rhBMP-2的硫酸鈣支架。術(shù)后4和8周行影像學(xué)和組織學(xué)分析，結(jié)果顯示載有辛伐他汀的硫酸鈣支架和載有rhBMP-2的硫酸鈣支架組治療的骨缺損的X射線評(píng)分和新生骨面積明顯的高于硫酸鈣支架組(P＜0.05)。但是載有辛伐他汀的硫酸鈣支架和載有rhBMP-2的硫酸鈣支架組在X射線評(píng)分和新生骨面積無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:體內(nèi)局部緩慢釋放的辛伐他汀能促進(jìn)骨組織的再生，而且這種促進(jìn)骨組

7、織再生的作用與rhBMP-2作用相似，這種載有辛伐他汀的硫酸鈣支架在骨組織工程中可能有很大的應(yīng)用前景。
　　 第二部分辛伐他汀對(duì)大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞和干細(xì)胞片的增殖、分化的作用
　　 目的:研究辛伐他汀對(duì)大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的影響以及對(duì)干細(xì)胞片的分化作用
　　 方法和結(jié)果:不同濃度的辛伐他汀與MSCs共培養(yǎng)1、3、7天后MTT檢測(cè)各種濃度的辛伐他汀對(duì)MSCs的增殖影響，當(dāng)辛伐他汀濃度高于1μ

8、M時(shí)將會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，在MTT實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，用0.01μM、0.1μM、1μM濃度的辛伐他汀與MSCs共培養(yǎng)，另設(shè)立未處理MSCs為對(duì)照組，3天和7天后檢測(cè)BMP-2，ALP，OCN，OPG和VEGF等基因表達(dá)差異;結(jié)果顯示辛伐他汀誘導(dǎo)組這些基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，而且隨著濃度的增高，基因表達(dá)量也增加;當(dāng)MSCs高濃度培養(yǎng)后可以形成細(xì)胞片層狀結(jié)構(gòu)，1μM辛伐他汀與MSC細(xì)胞片共培養(yǎng)7天后，檢測(cè)BMP-2，ALP，OCN，OP

9、G和VEGF等基因表達(dá)情況，另設(shè)立未處理MSC細(xì)胞片組作為對(duì)照組，結(jié)果顯示:辛伐他汀誘導(dǎo)MSC細(xì)胞片組的BMP-2，ALP，OCN，OPG和VEGF等基因表達(dá)量顯著高于未處理MSC細(xì)胞片組。
　　 結(jié)論:低濃度的辛伐他汀能促進(jìn)MSCs和MSC細(xì)胞片的骨向分化和血管發(fā)生，這種具有骨向分化和血管發(fā)生的MSC細(xì)胞片在骨組織工程中將有廣闊的應(yīng)用前景。
　　 第三部分骨向分化和血管發(fā)生的MSC細(xì)胞片促進(jìn)骨折愈合的應(yīng)用研究
　

10、　 目的:辛伐他汀誘導(dǎo)后的具有骨向分化和血管發(fā)生的MSC細(xì)胞片能加速骨折愈合。
　　 方法和結(jié)果:大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)高密度培養(yǎng)形成MSC細(xì)胞片，然后與1μM辛伐他汀共培養(yǎng)7天后，取下細(xì)胞片用于體內(nèi)移植。20只大鼠，在其脛骨中上段鋸斷制造骨折模型，用1mm的注射器針頭髓內(nèi)固定，在骨折處用辛伐他汀誘導(dǎo)后的MSC細(xì)胞片包裹，未處理組作為空白對(duì)照，術(shù)后2周和8周進(jìn)行X線、micro-CT和組織學(xué)分析。術(shù)后2周和8周

11、MSC細(xì)胞片組的X線評(píng)分顯著高于對(duì)照組，組織學(xué)和micro-CT顯示:術(shù)后2周MSC細(xì)胞片組的骨折部位部分形成了連接，術(shù)后8周形成較好的骨性連接，而對(duì)照組纖維組織仍填充骨折處，形成骨不連。
　　 結(jié)論:具有骨向分化和血管發(fā)生的MSC細(xì)胞片促進(jìn)骨組織再生，治愈了脛骨骨折。這種方法可能有助于臨床中骨折、骨折延遲愈合和骨不連的治療。
　　 第四部分磷酸鈣納米顆粒、富含血小板血漿對(duì)大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖、分化作用

12、>　　 目的:研究磷酸鈣納米顆粒、富含血小板血漿對(duì)大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞增殖、分化的影響。
　　 方法和結(jié)果:制備直徑140nm左右的磷酸鈣納米顆粒和從大鼠心臟血中提取富含血小板血漿（PRP）。將不同濃度的磷酸鈣納米顆粒(0.001％，0.01％，0.1％)與MSCs共培養(yǎng)1、3、7天后MTT檢測(cè)各種濃度的磷酸鈣納米顆粒對(duì)MSCs的增殖影響，結(jié)果顯示磷酸鈣納米顆粒對(duì)MSCs的增殖具有濃度依賴性的抑制作用，當(dāng)磷酸鈣納米顆粒濃

13、度為0.01％，0.1％時(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制作用，0.001％濃度的磷酸鈣納米顆粒對(duì)MSCs增殖無(wú)影響;在MTT實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，用0.001％濃度的磷酸鈣納米顆?；?.001％濃度的磷酸鈣納米顆粒復(fù)合PRP與MSCs共培養(yǎng)，另設(shè)立MSCs為對(duì)照組，7天后檢測(cè)ALP和OCN基因表達(dá)差異;結(jié)果顯示:磷酸鈣納米顆粒誘導(dǎo)組這些基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，茜素紅染色顯示有骨向分化的鈣結(jié)節(jié);當(dāng)PRP(10μL)與磷酸鈣顆粒共同與MSCs培養(yǎng)時(shí)，磷酸鈣

14、納米顆粒與PRP共同誘導(dǎo)組的這些基因的表達(dá)量進(jìn)一步提高，鈣化結(jié)節(jié)更明顯。
　　 結(jié)論:磷酸鈣納米顆粒對(duì)MSCs的增殖有濃度依賴性;磷酸鈣納米顆粒能促進(jìn)MSCs的骨向分化;PRP聯(lián)合磷酸鈣納米顆粒能協(xié)同作用促進(jìn)MSCs的骨向分化。
　　 第五部分間充質(zhì)干細(xì)胞片復(fù)合富含血小板血漿凝膠/納米磷酸鈣修復(fù)骨缺損的研究
　　 目的:間充質(zhì)干細(xì)胞片聯(lián)合富含血小板血漿凝膠/納米磷酸鈣復(fù)合物能協(xié)同作用促進(jìn)骨組織再生修復(fù)。
　

15、　 方法和結(jié)果:大鼠骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)高密度培養(yǎng)形成MSC細(xì)胞片，制備直徑140nm左右的磷酸鈣納米顆粒和從大鼠心臟血中提取富含血小板血漿，將10μL PRP、10μL激活劑（含100U/ml牛凝血酶的10％氯化鈣溶液）和10mg磷酸鈣顆粒同時(shí)混合，然后放入37℃培養(yǎng)箱使之反應(yīng)形成凝膠/顆?；旌衔?。當(dāng)MSCs形成細(xì)胞片后，將已經(jīng)制作好的PRP凝膠/磷酸鈣顆?；旌衔锓诺秸归_的細(xì)胞片上，用細(xì)胞片包裹混合物后即得到細(xì)胞片包裹

16、的PRP凝膠/磷酸鈣顆粒混合物;細(xì)胞片包裹單獨(dú)的磷酸鈣顆粒為細(xì)胞片/磷酸鈣顆?；旌衔铩?0只大鼠，在股骨中段做一個(gè)2.5×5.0mm的骨缺損，在骨缺損分別植入納米磷酸鈣、PRP凝膠/納米磷酸鈣、MSC細(xì)胞片/納米磷酸鈣、MSC細(xì)胞片/PRP凝膠/納米磷酸鈣，未處理組作為空白對(duì)照，術(shù)后4周進(jìn)行大體觀察、X線和組織學(xué)分析。另外為了追蹤移植的MSC細(xì)胞片的存活情況，MSCs首先用CM-Dil標(biāo)記，然后再培養(yǎng)成MSC細(xì)胞片，然后包裹PRP凝膠/

17、納米磷酸鈣植入到另外2只大鼠的4個(gè)骨缺損處，術(shù)后2周用Maestro動(dòng)物多光譜影像系統(tǒng)和激光共聚焦進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示:植入的MSC細(xì)胞片能夠存活。術(shù)后4周組織學(xué)顯示:MSC細(xì)胞片/PRP凝膠/納米磷酸鈣組的骨缺損被均勻一致的較厚的皮質(zhì)骨填充，新生骨面積明顯多于其它四組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論: MSC細(xì)胞片聯(lián)合PRP凝膠/磷酸鈣顆粒復(fù)合物能有效的促進(jìn)骨組織再生，移植后的MSC細(xì)胞片在缺損部位能存活并參與骨修復(fù)，這種MSC細(xì)