富集骨髓干細胞復合磷酸三鈣移植促進骨修復.pdf

1、研究背景和目的:骨修復是長期以來臨床骨科普遍存在、并急需解決的問題。自體骨或異體骨移植雖然為骨修復提供了途經(jīng)，但都存在一定缺陷。目前應用干細胞技術和組織工程的手段促進骨修復的研究受到廣泛重視，相關的實驗研究發(fā)展迅速。但由于包括倫理學在內(nèi)的種種因素，其臨床應用一直未能順利開展。本研究避開技術上與倫理學方面限制干細胞技術在臨床應用的多種因素，首次研究在手術同期，應用富集骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)快速復合β-磷酸三鈣(β-TCP)移植促進骨

2、修復的可行性、效果、臨床價值及影響因素。 方法整個研究分為五部分： 1．快速富集技術對人骨髓MSCs影響的研究 通過測定富集前后骨髓有核細胞(NCs)和骨髓MSCs數(shù)量變化，骨髓MSCs增殖活性、細胞周期、凋亡、細胞分布(細胞表面標志物)情況的變化，和MSCs成骨活性的改變，來綜合評價富集技術對人骨髓MSCs的影響。 2．富集骨髓MSCs快速復合多孔β-TCP的體外研究。 應用負壓技術將富集骨髓M

3、SCs與多孔β-TCP復合2h、4h、24h和4811后，掃描電鏡觀察富集MSCs在β-TCP中的黏附情況，測定不同復合時間MSCs的D-葡萄糖代謝情況來觀察時間對復合效果的影響；倒置顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察復合材料表面和內(nèi)部MSCs的生長狀況；利用測定復合β-TCP和單純平面培養(yǎng)的骨髓MSCs培養(yǎng)基中D-葡萄糖和L-乳酸含量的變化，以及DNA相對定量實驗，觀察比較MSCs復合β-TCF培養(yǎng)與單純平面培養(yǎng)的生長狀況。 3．富

4、集人骨髓MSCs復合多孔β-TCP在裸鼠體內(nèi)異位成骨的研究。 隨機分實驗組(富集骨髓MSCs／β-TCP)和對照組(單純β-TCP)，將β-TCP顆粒材料分別植入12只裸鼠右股后肌袋內(nèi)，于4、8周分別進行大體觀察、材料中部掃描電鏡觀察、x線觀察、骨密度測定和組織學觀察。應用圖像軟件對X線片中材料組織塊的相對密度進行測量，觀察降解和成骨情況。 4．富集骨髓MSCs復合多孔β-TCP促進羊脊柱后路融合的實驗研究建立羊后路脊柱

5、融合動物模型，將12只羊的6個腰椎，共36節(jié)段，按植入材料隨機分為A組(自體富集骨髓MSCs/β-TCP)、B組(單純β-TCP)和C組(自體髂骨)。于術后12、24周分批取樣，分別進行大體檢查判斷融合情況、X線觀察材料降解情況、CT橫斷掃描進行融合評分、無間隔掃描計算新生骨體積、骨密度測量融合區(qū)的礦化密度、生物力學檢測融合節(jié)段的最大載荷、剛度以及組織學觀察新骨形成率和β-TCP材料的降解率。 5．富集骨髓MSCs復合多孔β-T

6、CP促進骨修復的臨床研究應用富集骨髓MSCs復合多孔β-TCP共治療臨床患者47例(脊柱融合40例、骨不連6例、骨囊腫l例)，通過C0BE 2991<,’TM>血細胞分選系統(tǒng)，快速富集骨髓MSCs，在術中復合多孔β-TCP后，進行回植治療。通過體外誘導培養(yǎng)，測定堿性磷酸酶(ALP)染色陽性的細胞集落(CFU)數(shù)量變化及來評價富集MSCs效率，觀察年齡、性別和原發(fā)病種對骨髓MSCs的影響，分析骨髓NCs和MSCs富集倍數(shù)的相關性。并通過細

7、菌學檢測，臨床隨訪，x線、CT檢查評價安全性和治療效果。 結果： 1．富集前后骨髓MSCs均增殖良好。富集后骨髓NCs和MSCs數(shù)量明顯增加，P<0.01。生長曲線顯示：富集前后MSCs增殖活力無顯著變化，P>0.05。富集后增殖期MSCs相對比例減少，P<0.05。富集前后MSCs正常、凋亡、機械損傷和壞死細胞的比例均無顯著變化，P>0.05。富集后CD45-、CD34-/CD45-的細胞相對比例有所減少，P<0.0

8、5。富集前后原代貼壁細胞中CD34-、CD45-、CD34-/CD45-、CDl05+、CD90+和CD44+的細胞相對比例無顯著的差異，P>0.05。富集后原代骨髓MSCs的ALP、V0nK0ssa染色顯示成骨活性增強。 2．掃描電鏡觀察快速復合2h已有部分MSCs貼壁，24h后貼壁細胞最多，48h已有膠原基質(zhì)分泌；經(jīng)體外培養(yǎng)，復合后多孔β-TCP內(nèi)部有較多MSCs生長。復合24h組的富集MSCs對D-葡萄糖的消耗最多。倒置顯

9、微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察，富集MSCs可在多孔β-TCP材料表面和深部孔隙中良好生長。復合β-TCP的MSCs對D-葡萄糖和L一乳酸代謝顯著高于單純平面培養(yǎng)的MSCs，P<0.05。DNA相對定量顯示復合β-TCP組比單純平面培養(yǎng)組，MSCs的數(shù)量更多，P<0.05。 3.實驗組(富集骨髓MSCs／β-TCP)和對照組(單純β-TCP)裸鼠傷口均良好愈合。掃描電鏡觀察，在多孔β-TCP的中心，實驗組有大量的組織細胞生長，而對照

10、組基本無細胞生長。x線觀察，8周時材料密度下降，實驗組材料組織塊的相對密度值比對照組下降更明顯。與實驗組DEXA值下降明顯(P<0.05)相一致。脫鈣組織學觀察：8周時，實驗組有3／6例發(fā)現(xiàn)異位成骨，對照組無成骨現(xiàn)象。 4.富集后羊骨髓MSC：s顯著增加，P<0.01。大體觸摸判斷羊脊柱融合，A組(富集骨髓MSCs／β-Tcp)92％(11／12)，B組(單純β-TCP)58％(7／12)，C組(自體骨)75％(9／12)，P>

11、0.05。CT掃描測定脊柱融合率A、B、C三組分別為92％(11／12)、58％(7／12)，100％(12／12)，P<0.05。X線觀察，4周起A、B組融合區(qū)密度下降明顯，第12周后，A組密度有所回升。C組自第4周起融合區(qū)密度逐漸上升。CT掃描12周時A、C兩組椎板外側有大量的新骨形成，B組新骨形成少。CT對新生骨組織體積重建，A組>B組，P<0.05。 DExA檢測結果與X線觀察一致，4周時A、B組植骨區(qū)的BMD值>C組B

12、MD值，P<0.05。12周時A組>C組，P<0.05,24周時，三組間無統(tǒng)計學差異。4周起，A、B組BMD值隨時間有先下降再回升的趨勢，而C組BMD值隨時間顯著上升。生物力學檢測融合節(jié)段的最大耐受載荷，12周時A、C組>B組，P<0.05，24周時，三組間均值大小為，A>C組>B組，但P>0.05。融合節(jié)段剛度，12周時三組均值順序為，C組>A組>B組，P>0.05。24周時，三組剛度均有顯著上升，P<0.05，且C組>B組，P<0.

13、05。 脫鈣組織學觀察，12周時A、C組融合區(qū)有大量新生板層骨組織，B組新生骨組織少，24周時，A、C組融合區(qū)骨改建明顯，B組骨小梁結構較差。不脫鈣組織學觀察，12周時，A組同時可觀察到殘留材料位于新生骨組織的表面和深部，B組材料僅見于新生骨組織表面，C組可見新生骨組織對移植骨的爬行替代。骨組織形態(tài)學計量，新骨形成率A、C組>B組，P<0.01。β-TCP降解較快，12周時A、B組中β-TCf的降解率為93％和92％。

14、5．臨床治療中獲得骨髓血約250±37ml／例，富集回收約50±19ml／例，骨髓MSCs回收率約占78％，骨髓MSCs由(231±251)／ml濃縮至(743±651)／ml。骨髓MSCs的自然對數(shù)與年齡成線性負相關(r=-0.4910，P<0.05)，NCs的自然對數(shù)與年齡相關性不大(r=-0.0469、P>O.05)。男、女性的骨髓NCs和MSCs數(shù)量無統(tǒng)計學差別 (P>0.05)。骨髓MSCs數(shù)，骨折組>退變組(P<0.05)。

15、通過富集，NCs與MSCs的增長倍數(shù)成線性正相關(r=0.4054，P<0.05)。臨床病例隨訪13.5±6.3個月，總體有效率為95.6％。富集血樣細菌學檢測陰性率100％。4例術后傷口有滲出或腫脹，均自行痊愈。 結論： 1．體外快速富集技術，提高單位體積內(nèi)的骨髓NCs和MSCs的數(shù)量。不影響MSCs的增殖活力，不增加MSCs的凋亡、機械損傷或壞死的比例。通過富集技術獲得的骨髓血是一富含MSCs的多種細胞成分的混合體

16、，體外誘導觀察證實其成骨活性比原始骨髓血更強。 2．富集骨髓MSCs快速復合β-rcP，可使骨髓MSCs進入多孔β-TCP內(nèi)部，復合2h即有細胞黏附于材料內(nèi)壁，復合24h黏附效率較高。體外培養(yǎng)，富集骨髓MSCs可在多孔β-TCP內(nèi)部、表面生長增殖，比單純平面培養(yǎng)的富集MSCs生長代謝更旺盛、細胞增殖更明顯。通過該方法可在體外快速構建富集MSCs／β-TCP生物活性材料。 3．富集人骨髓MSCs／β-TCP顆粒具有較好的生

17、物相容性，富集MSCs通過復合能進入多孔β-TCP內(nèi)部，并在裸鼠體內(nèi)增殖生長：8周時，裸鼠體內(nèi)富集MSCs／β-TCP材料密度顯著下降，接近骨密度，具有異位成骨能力。 4．自體富集骨髓MSCs／β-TCP可促進羊脊柱后路融合，其成骨能力、對羊脊柱后路融合率與自體骨相當，明顯優(yōu)于單純β-TCP材料。可能主要歸因于富集骨髓MSCs的自身成骨潛能與多孔β-TCP骨傳導性結合所產(chǎn)生的成骨活性。在β-TCP快速降解的同時，富集骨髓MSCs