人臍帶間充質(zhì)干細胞聯(lián)合富含血小板血漿修復跟腱損傷的實驗研究.pdf

1、肌腱損傷是最常見的運動損傷，分為急性和慢性損傷，修復過程緩慢，其正常結(jié)構(gòu)與功能恢復困難，絕大多數(shù)為肌腱纖維化及瘢痕修復;跟腱作為完成走、跑、跳等動作不可或缺的肌腱，在肌腱損傷中最為常見。
　　隨著干細胞生物學和技術(shù)的迅猛發(fā)展，間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)備受關(guān)注，骨髓、脂肪、肌腱以及胚胎組織等來源的干細胞也已經(jīng)在臨床前及臨床研究中用于促進肌腱損傷的修復治療，但很多都有其本身缺陷、比如異位骨

2、化、脂肪化、成瘤及取材的有創(chuàng)性等。
　　人臍帶間充質(zhì)干細胞(Human Umbilical cord Mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)主要來源于臍帶組織中的華通氏膠(Wharton's jelly)，具有干細胞更原始、增殖分化能力強、免疫原性低、免疫調(diào)節(jié)功能、抗腫瘤、適合異體移植、取材方便、數(shù)量充足、無倫理學爭議等優(yōu)點。一項動物實驗表明，使用同種異體臍帶間充質(zhì)干細胞治療賽馬的肌腱病取得了很好的效果。

3、
　　富含血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)是經(jīng)過離心從靜脈血提取的血小板含量超過1×106個/uL的血漿，因含有多種生長因子，是肌腱損傷修復的另一研究熱點;相關(guān)臨床前及臨床研究表明，PRP對促進肌腱損傷修復是有效的。一項動物研究表明PRP聯(lián)合大鼠肌腱干細胞(Tendon stem cells，TSCs)能較二者單獨使用更好的促進大鼠受損跟腱的修復。
　　在大部分PRP促進受損肌腱組織修復的研究中

4、，PRP的濃度不同。一項體外研究發(fā)現(xiàn)，PRP的濃度可以影響肌腱細胞的增殖、分化、遷移以及分泌等行為，且高濃度的PRP對細胞的上述行為是無益的。
　　基于上述基礎(chǔ)，我們推測PRP濃度對hUC-MSCs的增殖、分化是有影響的，PRP聯(lián)合hUC-MSCs能有效促進跟腱損傷的修復。因目前尚未見將PRP聯(lián)合hUC-MSCs用于修復受損肌腱的相關(guān)報道，為此本研究將試圖明確不同濃度PRP對hUC-MSCs增殖的影響，不同濃度的PRP對hUC-M

5、SCs成肌腱分化的影響以及PRP聯(lián)合hUC-MSCs對受損跟腱修復的作用。
　　目的:
　　(1)明確不同濃度PRP在體外對hUC-MSCs增殖的影響;
　　(2)觀察不同濃度PRP在體外對hUC-MSCs成肌腱分化的影響;
　　(3)評估hUC-MSCs聯(lián)合PRP對大鼠跟腱損傷修復的影響。
　　方法:
　　(1)不同濃度PRP在體外對hUC-MSCs增殖的影響:PRP活化后成為PRP-clotrel

6、easate(PRCR);取P3代hUC-MSCs接種于細胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h觀察細胞完全貼壁后，分別加入含0％（對照組）、10％、20％、40％體積濃度PRCR的DMEM/F12培養(yǎng)基，于1、2、3、4天以細胞計數(shù)試劑盒（Cell counting kits-8，CCK-8）測定各組hUC-MSCs的OD值以反映細胞增殖速度。
　　(2)不同濃度PRP在體外對hUC-MSCs成肌腱分化的影響:取P3代hUC-MSCs接種于細胞

7、培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h觀察細胞完全貼壁后，分別加入含0％（對照組）、10％、20％、40％體積濃度PRCR的DMEM/F12培養(yǎng)基，于1、3、5天收集各組細胞并提取蛋白，Western blot檢測hUC-MSCs中成肌腱分化標志性基因TNC、SCX、ColI的蛋白表達水平。
　　(3)評估hUC-MSCs聯(lián)合PRP對大鼠跟腱損傷修復的影響:選取48只8周齡雄性SD大鼠，50μ LⅠ型膠原酶注射于大鼠右側(cè)跟腱制備跟腱損傷模型，3天后

8、于損傷部位按生理鹽水（對照）、hUC-MSCs，PRP、PRP+hUC-MSCs的分組再次注射100μ L，術(shù)后2W、4W安樂死大鼠，Western blot檢測各組跟腱組織中TNC、SCX及ColI的蛋白表達情況，跟腱組織切片HE染色行組織學評估。
　　結(jié)果:
　　(1)加入含不同體積濃度PRCR培養(yǎng)基的1、2、3、4d時，CCK-8檢測各組在450nm處的OD值。除2d的40％PRCR組hUC-MSCs增殖速度稍快于對照

9、組外(P＞0.05)，實驗組hUC-MSCs增殖速度均明顯快于對照組(P＜0.05)，其中1d時40％PRCR細胞增殖速度最快，2、3、4d時，均為20％PRCR組中的細胞增殖速度最快;實驗組中不同濃度的PRCR在體外對hUC-MSCs的增殖均有促進作用，而其中以20％PRCR的促細胞增殖效應最明顯。
　　(2)加入含不同體積濃度PRCR培養(yǎng)基的1、3、5d時，各組細胞蛋白收集后采用Western blot檢測ColI，SCX及T

10、NC的蛋白表達水平。在所有時間點，20％PRCR組的表達量均明顯高于其它組（P＜0.05）;1d時，40％PRCR組中ColI的表達量與對照組差別不明顯(P＞0.05);3、5d時，40％PRCR組中SCX及TNC的表達量與對照組差別不明顯(P＞0.05);其余時間點，各實驗組ColI，SCX及TNC的蛋白表達水平均明顯高于對照組(P＜0.05)。
　　(3)按照實驗分組于大鼠跟腱體部行注射性治療后的2w、4w，采用Western

11、 blot測定各組大鼠跟腱中ColI、SCX、TNC的蛋白表達水平。除術(shù)后4W，PRP組、hUC-MSCs組的TNC蛋白表達水平與對照組無顯著差異外(P＞0.05)，其余各實驗組在2W、4W的ColI、SCX、TNC的蛋白表達水平均顯著高于對照組(P＜0.05); ColI，SCX及TNC的表達量在全部時間點均以PRP+hUC-MSCs組最高。
　　(4)按照動物實驗分組將術(shù)后2w、4w的大鼠跟腱組織切片并行H.E染色，觀察跟腱組

12、織的纖維結(jié)構(gòu)、纖維排列和炎性反應等組織學指標。術(shù)后2W，PRP注射組及對照組跟腱組織中膠原纖維的排列紊亂、無序，炎性細胞浸潤較多;PRP+hUC-MSCs注射組及hUC-MSCs注射組跟腱組織中膠原纖維的結(jié)構(gòu)更加完整，排列更加整齊、有序，炎性細胞浸潤更少;其中PRP+hUC-MSCs組在以上三項組織學指標的表現(xiàn)最好。術(shù)后4W，各組跟腱組織的纖維結(jié)構(gòu)、纖維排列和炎性反應等組織學表現(xiàn)均較該組2W時的組織學表現(xiàn)更優(yōu);hUC-MSCs組以及PR

13、P+hUC-MSCs組的組織學表現(xiàn)均優(yōu)于對照組，其中PRP+hUC-MSCs組在以上三項組織學指標的表現(xiàn)最好，而PRP組對受損跟腱愈合的改善不明顯。
　　結(jié)論:
　　(1)PRP的濃度可以影響hUC-MSCs的增殖速度，而適宜濃度PRP（20％體積濃度）在體外可以顯著促進hUC-MSCs的增殖。
　　(2)PRP的濃度可以影響hUC-MSCs的分化，適宜濃度PRP（20％體積濃度）在體外可以顯著促進hUC-MSCs成肌