GPI-PLD過表達釋放GPI錨定PSCA對前列腺癌細胞生物學的影響.pdf

1、目的:
　　 初步研究GPI-PLD基因過表達對前列腺癌PC-3細胞株GPI-PLD酶活性的影響，探討GPI-PLD釋放前列腺干細胞抗原(PSCA)后前列腺癌PC-3細胞株生物學功能的改變，進一步探討PSCA的生物學功能和在前列腺癌發(fā)病過程中的作用與地位，為運用GPI-PLD基因治療前列腺癌等腫瘤性疾病打下堅實基礎。
　　 方法:
　　 1.收集26例正常人外周血血清和18例前列腺癌患者外周血血清，測定其GPI-

2、PLD酶活性。
　　 2.采用梭華-Sofast陽離子聚合物將本實驗室已經構建的真核表達載體pcDNA3.1(+)/GPI-PLD轉入前列腺癌PC-3細胞，以轉染空載體的pcDNA3.1(+)的PC-3細胞組、未轉染的PC-3細胞組為對照，800ug/mL G418篩選出穩(wěn)定表達的陽性細胞克隆。
　　 3.逆轉錄酶-PCR(RT-PCR)檢測轉染前后細胞內GPI-PLDmRNA水平。利用本實驗室自制的具有完整GPI結構的

3、胎盤型堿性磷酸酶(placental-type alkaline phosphatase，PLAP)作為底物，定量檢測穩(wěn)定轉染前后細胞內GPI-PLD酶活性。ELISA法檢測各組細胞PSCA的釋放情況，流式細胞術檢測細胞表面GPI錨定的PSCA表達水平以及細胞周期和凋亡率，細胞計數法測定細胞生長曲線。
　　 結果:
　　 1.前列腺癌患者和正常人對照組外周血血清GPI-PLD酶活性（轉化底物PLAP的百分率）分別為29.

4、79％±4.13％和38.27％±5.73％，前列腺癌患者比正常人對照組的GPI-PLD酶活性明顯下降，差異具有顯著統計學意義(P＜0.01)。
　　 2.RT-PCR結果和GPI-PLD酶活性測定結果表明，穩(wěn)定高表達GPI-PLD的前列腺癌PC-3細胞系已經建立。①經G418篩選后，穩(wěn)定轉染GPI-PLD的PC-3細胞組GPI-PLD mRNA相對表達量較轉染pcDNA3.1(+)的PC-3細胞組和未轉染的PC-3細胞組明顯增

5、高，GPI-PLD mRNA表達水平（相對灰度值，IA比值）分別為0.976±0.041、0.549±0.032和0.522±0.047，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。②相比轉染pcDNA3.1(+)的PC-3細胞組和未轉染的PC-3細胞組，穩(wěn)定轉染GPI-PLD的PC-3細胞中GPI-PLD酶活性明顯增高，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)，轉染GPI-PLD的PC-3細胞組中GPI-PLD酶活性(轉化底物PLAP的百分率)

6、達到24.47％±6.89％，轉染pcDNA3.1(+)的PC-3細胞組和未轉染的PC-3細胞組GPI-PLD酶活性(％)相對較低，分別為11.63％±6.04％和10.10％±5.38％。
　　 3.ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基上清中釋放的PSCA濃度結果顯示，轉染GPI-PLD的PC-3細胞組培養(yǎng)基上清中PSCA濃度為146.96±3.32pg/mL，轉染pcDNA3.1(+)組和未轉染組這一值分別為90.66±3.19pg/

7、mL和89.24±1.77 pg/mL，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。
　　 4.流式細胞術檢測細胞表面GPI錨定蛋白質PSCA水平結果顯示，相比pcDNA3.1(+)/PC-3細胞組和PC-3細胞組，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3細胞組的平均熒光強度顯著降低，有顯著性統計學意義(P＜0.01)。GPI-PLD轉染組平均熒光強度為59.79±0.92，而其他兩對照組分別為85.63±1.30和85.97

8、±1.23。
　　 5.流式細胞術檢測細胞周期結果顯示，相比pcDNA3.1(+)/PC-3細胞組和PC-3細胞組，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3細胞組的G0-G1顯著上升，S期顯著下降，G2期略有下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。細胞計數和細胞生長曲線表明，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3細胞組生長速度較pcDNA3.1(+)/PC-3細胞組和PC-3細胞組明顯減慢。凋亡結果顯示，pcD

9、NA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3細胞組相對于其他兩個組，凋亡值顯著上升，差異有顯著統計學意義(P＜0.01)。
　　 結論:
　　 1.前列腺癌患者較正常人的外周血血清GPI-PLD酶活性顯著降低，提示前列腺癌患者GPI-PLD基因表達下調。
　　 2.成功構建GPI-PLD基因穩(wěn)定過表達的前列腺癌PC-3細胞株。
　　 3.GPI-PLD基因過表達能成功釋放PC-3細胞膜上GPI錨定蛋白質PS