GPI-PLD過表達(dá)釋放GPI錨定PSCA對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)的影響.pdf

1、目的:
　　 初步研究GPI-PLD基因過表達(dá)對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞株GPI-PLD酶活性的影響，探討GPI-PLD釋放前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)后前列腺癌PC-3細(xì)胞株生物學(xué)功能的改變，進(jìn)一步探討PSCA的生物學(xué)功能和在前列腺癌發(fā)病過程中的作用與地位，為運(yùn)用GPI-PLD基因治療前列腺癌等腫瘤性疾病打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.收集26例正常人外周血血清和18例前列腺癌患者外周血血清，測(cè)定其GPI-

2、PLD酶活性。
　　 2.采用梭華-Sofast陽(yáng)離子聚合物將本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)構(gòu)建的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/GPI-PLD轉(zhuǎn)入前列腺癌PC-3細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染空載體的pcDNA3.1(+)的PC-3細(xì)胞組、未轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞組為對(duì)照，800ug/mL G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞克隆。
　　 3.逆轉(zhuǎn)錄酶-PCR(RT-PCR)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)GPI-PLDmRNA水平。利用本實(shí)驗(yàn)室自制的具有完整GPI結(jié)構(gòu)的

3、胎盤型堿性磷酸酶(placental-type alkaline phosphatase，PLAP)作為底物，定量檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞內(nèi)GPI-PLD酶活性。ELISA法檢測(cè)各組細(xì)胞PSCA的釋放情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面GPI錨定的PSCA表達(dá)水平以及細(xì)胞周期和凋亡率，細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 結(jié)果:
　　 1.前列腺癌患者和正常人對(duì)照組外周血血清GPI-PLD酶活性（轉(zhuǎn)化底物PLAP的百分率）分別為29.

4、79％±4.13％和38.27％±5.73％，前列腺癌患者比正常人對(duì)照組的GPI-PLD酶活性明顯下降，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2.RT-PCR結(jié)果和GPI-PLD酶活性測(cè)定結(jié)果表明，穩(wěn)定高表達(dá)GPI-PLD的前列腺癌PC-3細(xì)胞系已經(jīng)建立。①經(jīng)G418篩選后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPI-PLD的PC-3細(xì)胞組GPI-PLD mRNA相對(duì)表達(dá)量較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的PC-3細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞組明顯增

5、高，GPI-PLD mRNA表達(dá)水平（相對(duì)灰度值，IA比值）分別為0.976±0.041、0.549±0.032和0.522±0.047，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。②相比轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的PC-3細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞組，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染GPI-PLD的PC-3細(xì)胞中GPI-PLD酶活性明顯增高，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，轉(zhuǎn)染GPI-PLD的PC-3細(xì)胞組中GPI-PLD酶活性(轉(zhuǎn)化底物PLAP的百分率)

6、達(dá)到24.47％±6.89％，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的PC-3細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞組GPI-PLD酶活性(％)相對(duì)較低，分別為11.63％±6.04％和10.10％±5.38％。
　　 3.ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中釋放的PSCA濃度結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染GPI-PLD的PC-3細(xì)胞組培養(yǎng)基上清中PSCA濃度為146.96±3.32pg/mL，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)組和未轉(zhuǎn)染組這一值分別為90.66±3.19pg/

7、mL和89.24±1.77 pg/mL，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 4.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面GPI錨定蛋白質(zhì)PSCA水平結(jié)果顯示，相比pcDNA3.1(+)/PC-3細(xì)胞組和PC-3細(xì)胞組，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3細(xì)胞組的平均熒光強(qiáng)度顯著降低，有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。GPI-PLD轉(zhuǎn)染組平均熒光強(qiáng)度為59.79±0.92，而其他兩對(duì)照組分別為85.63±1.30和85.97

8、±1.23。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示，相比pcDNA3.1(+)/PC-3細(xì)胞組和PC-3細(xì)胞組，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3細(xì)胞組的G0-G1顯著上升，S期顯著下降，G2期略有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線表明，pcDNA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3細(xì)胞組生長(zhǎng)速度較pcDNA3.1(+)/PC-3細(xì)胞組和PC-3細(xì)胞組明顯減慢。凋亡結(jié)果顯示，pcD

9、NA3.1(+)/GPI-PLD/PC-3細(xì)胞組相對(duì)于其他兩個(gè)組，凋亡值顯著上升，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1.前列腺癌患者較正常人的外周血血清GPI-PLD酶活性顯著降低，提示前列腺癌患者GPI-PLD基因表達(dá)下調(diào)。
　　 2.成功構(gòu)建GPI-PLD基因穩(wěn)定過表達(dá)的前列腺癌PC-3細(xì)胞株。
　　 3.GPI-PLD基因過表達(dá)能成功釋放PC-3細(xì)胞膜上GPI錨定蛋白質(zhì)PS