交感神經(jīng)經(jīng)β腎上腺素能受體途徑調(diào)控急性肝損傷的研究.pdf

1、一、背景:
　　 肝臟大范圍手術(shù)或肝外傷和嚴(yán)重的細(xì)菌或病毒感染以及藥物中毒可引起急性肝損傷，造成肝臟功能不全甚至繼續(xù)進(jìn)展導(dǎo)致肝功能衰竭而使患者死亡。而目前對(duì)于急性肝損傷的救治，臨床上的藥物治療效果仍然十分有限，其機(jī)制也不十分明確。
　　 肝組織內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)控可分為體液調(diào)控和神經(jīng)調(diào)控兩方面。目前對(duì)肝臟炎癥反應(yīng)的調(diào)控研究主要在體液調(diào)控方面，而神經(jīng)調(diào)控研究相對(duì)較少。近年來(lái)研究表明，刺激交感神經(jīng)興奮可使炎癥狀態(tài)下的肝損傷加重，

2、而去除交感神經(jīng)則可緩解肝損傷，促進(jìn)肝損傷的恢復(fù)。
　　 國(guó)外及我們前期的研究表明，交感神經(jīng)可通過(guò)分泌去甲腎上腺素激動(dòng)Kupffer細(xì)胞上的α腎上腺素能受體而調(diào)控肝臟炎癥的進(jìn)展；Kupffer細(xì)胞上同樣也分布有β腎上腺素能受體，有研究報(bào)道在敗血癥后期，Kupffer細(xì)胞上β腎上腺素能受體表達(dá)上升并與炎癥調(diào)控有關(guān)系。但這一調(diào)控途徑的分子機(jī)制至今仍不清楚。因此我們?cè)O(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)以探討交感神經(jīng)興奮是否通過(guò)β腎上腺素能受體途徑來(lái)調(diào)控急性肝

3、損傷，以及這一作用的分子機(jī)制。
　　 一、目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用β腎上腺素能受體激動(dòng)劑和阻滯劑作用于急性肝損傷大鼠，觀察其對(duì)急性肝損傷大鼠肝功能的影響；并通過(guò)在體和離體研究探討Kupffer細(xì)胞在交感神經(jīng)經(jīng)β腎上腺素能受體途徑調(diào)控急性肝損傷中的作用及其機(jī)制。
　　 三、方法:
　　 1 SD大鼠腹腔內(nèi)注射ISO(異丙腎上腺素)，激動(dòng)β腎上腺素能受體，模擬交感神經(jīng)興奮β腎上腺素能受體，以正常大鼠為陰性

4、對(duì)照，應(yīng)用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)外周血中ALT、AST、Alb、TBil的變化情況，肝臟組織HE染色觀察病理學(xué)變化，明確ISO是否具有肝臟毒性。
　　 2以不同劑量(1、10、100mg/kg)ISO激動(dòng)β腎上腺素能受體，應(yīng)用CCl4造成大鼠急性肝損傷，并在不同的損傷時(shí)相點(diǎn)(24、48、72、96h)取材，以無(wú)β腎上腺素能受體激動(dòng)的急性肝損傷大鼠為陰性對(duì)照，檢測(cè)外周血中ALT、AST、Alb、TBil的變化，HE染色觀察病理學(xué)變化

5、，探討β腎上腺素能受體激動(dòng)劑對(duì)急性肝損傷調(diào)控的劑量和時(shí)間依賴性。
　　 3 SD大鼠腹腔內(nèi)注射PRO(普萘洛爾)，阻斷β腎上腺素能受體激動(dòng)，抑制交感神經(jīng)興奮，應(yīng)用CCl4造成大鼠急性肝損傷，以無(wú)β腎上腺素能受體阻滯的急性肝損傷大鼠為陰性對(duì)照，應(yīng)用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)外周血中ALT、AST、Alb、TBil的變化情況，HE染色觀察病理學(xué)變化，探討阻斷β腎上腺素能受體激動(dòng)對(duì)急性肝損傷的影響。
　　 4 SD大鼠腹腔內(nèi)先注射氯

6、化釓消除大鼠肝臟內(nèi)的Kupffer細(xì)胞后，再注射ISO，興奮β腎上腺素能受體，應(yīng)用CCl4造成大鼠急性肝損傷，以無(wú)β腎上腺素能受體激動(dòng)的急性肝損傷大鼠為陰性對(duì)照，應(yīng)用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)外周血中ALT、AST、Alb、TBil的變化情況，HE染色觀察病理學(xué)變化，探討Kupffer細(xì)胞在β腎上腺素能交感神經(jīng)調(diào)控急性肝損傷中的作用。
　　 5應(yīng)用肝臟原位灌注、Ⅳ型膠原酶消化、Percoll密度梯度離心和選擇性貼壁等方法分離純化得到K

7、upffer細(xì)胞并進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)和ED2細(xì)胞免疫染色來(lái)鑒定。
　　 6 Kupffer細(xì)胞體外分四組培養(yǎng)：PBS組、LPS組、ISO+LPS組、PRO+ISO+LPS組，使用ELISA檢測(cè)IL-6的表達(dá)、real-time PCR檢測(cè)TIMP-1 mRNA的表達(dá)情況，初步探索交感神經(jīng)經(jīng)β腎上腺素能受體途徑調(diào)控急性肝損傷中的機(jī)制。
　　 四、結(jié)果:
　　 1單純注射ISO和正常大鼠在各項(xiàng)肝功能指標(biāo)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>

8、0.05)，ISO不會(huì)造成肝損傷。
　　 2大鼠肝損傷程度隨著ISO劑量的加大而加重(ALT：對(duì)照組336.2±140.5，1mg/kg組603.7±239.7，10mg/kg組838.6±448.5，100mg/kg組1571.5±714.7，P<0.05)；在急性肝損傷后第48h對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組各項(xiàng)肝功能指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(ALT：290.8±153.9，636.0±385.2，P<0.05；AST：521.0±296.8，2

9、289.1±1361.5，P<0.05；Alb：28.3±1.3，25.2±1.5，P<0.05；TBil：4.1±1.2，24.8±16.9，P<0.05)。
　　 3應(yīng)用PRO阻滯β腎上腺素能受體興奮，可有效防止大鼠急性肝損傷加重(ALT：激動(dòng)組606.0±154.9，阻滯組210.0±176.1，P<0.05)。
　　 4在去除了Kupffer細(xì)胞的情況下，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組相比，肝功能檢測(cè)指標(biāo)ALT、AST、TBil

10、均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 5 Latex-Beads顆粒吞噬實(shí)驗(yàn)提示95％以上的細(xì)胞具有吞噬能力，ED2抗體染色提示90%以上的細(xì)胞為染色陽(yáng)性細(xì)胞。
　　 6 ELISA檢測(cè)各組IL-6的表達(dá)：各實(shí)驗(yàn)組IL-6的濃度與PBS組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；ISO+LPS組IL-6濃度比LPS組低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；PRO+ISO+LPS組IL-6濃度相比ISO+LPS組升高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差

11、異(P<0.05)。Real-time PCR檢測(cè)各組TIMP-1 mRNA的表達(dá)：各實(shí)驗(yàn)組TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量與PBS組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；ISO+LPS組TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比LPS組低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；PRO+ISO+LPS組TIMP-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量相比ISO+LPS組升高且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 五、結(jié)論:
　　 1應(yīng)用β腎上腺素能

12、受體激動(dòng)劑，可加重CCl4所致大鼠急性肝損傷，當(dāng)阻滯β腎上腺素能受體的激動(dòng)，可緩解CCl4所致大鼠急性肝損傷。因此，交感神經(jīng)可經(jīng)β腎上腺素能受體途徑來(lái)調(diào)控急性肝損傷的進(jìn)程。
　　 2當(dāng)去除大鼠肝臟Kupffer細(xì)胞后，再興奮β腎上腺素能受體不能加重CCl4所致大鼠急性肝損傷。Kupffer細(xì)胞在交感神經(jīng)調(diào)控急性肝損傷過(guò)程中起到了媒介的作用。
　　 3交感神經(jīng)激動(dòng)KupfFer細(xì)胞上的β腎上腺素能受體，顯著抑制IL-6和T