實(shí)時(shí)示蹤研究艾滋病毒侵染巨噬細(xì)胞的行為與機(jī)制.pdf

1、巨噬細(xì)胞是人類(lèi)免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）的重要宿主細(xì)胞，但目前對(duì)于HIV侵染人原代巨噬細(xì)胞的機(jī)制尚不十分清楚。近年來(lái)，熒光納米標(biāo)記和單病毒示蹤技術(shù)為實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究病毒侵染細(xì)胞關(guān)鍵分子事件提供了有效方法。本研究構(gòu)建了一種量子點(diǎn)特異性標(biāo)記HIV-1核心內(nèi)部蛋白Vpr的方法，獲得了量子點(diǎn)熒光標(biāo)記病毒HIV-1-QD，并成功地應(yīng)用單顆粒示蹤技術(shù)研究了HIV-1病毒侵染人原代巨噬細(xì)胞的行為模式，

2、具體研究結(jié)果如下：
　　第一，量子點(diǎn)標(biāo)記病毒HIV-1-QD的制備及表征。把含有HIV-1前病毒全基因組質(zhì)粒pAD8、表達(dá)Vpr-AP融合蛋白的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Vpr-AP和表達(dá)生物素連接酶BirA的質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-BirA共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，并在細(xì)胞中導(dǎo)入生物素以及鏈霉親和素修飾的量子點(diǎn)，使得量子點(diǎn)在病毒組裝過(guò)程中包裝入子代病毒粒子，純化獲得HIV-1-QD病毒顆粒。對(duì)HIV-1-QD病毒進(jìn)行免疫熒光、

3、透射電鏡等表征，證實(shí)量子點(diǎn)成功包裝至HIV-1病毒核心內(nèi)部。病毒滴度測(cè)定結(jié)果表明標(biāo)記方法未對(duì)病毒的侵染能力產(chǎn)生顯著性影響。
　　第二，發(fā)現(xiàn)HIV-1-QD通過(guò)內(nèi)吞的方式侵染人原代巨噬細(xì)胞。利用構(gòu)建的HIV-1-QD病毒，結(jié)合病毒脂質(zhì)囊膜的親脂性染料DiO染色，獲得了雙標(biāo)記HIV-1-QD-DiO病毒顆粒，并將其用于病毒侵染巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIV-1-QD-DiO病毒粒子以主動(dòng)運(yùn)輸?shù)姆绞竭M(jìn)入巨噬細(xì)胞。HIV-1-Q

4、D-DiO病毒粒子的包膜熒光信號(hào)DiO和核心QD熒光信號(hào)共定位進(jìn)入到巨噬細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)一步實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究HIV-1-QD病毒粒子與巨噬細(xì)胞網(wǎng)格蛋白和早期內(nèi)體標(biāo)志物Rab5A的相互作用，表明HIV-1通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞進(jìn)入巨噬細(xì)胞，繼而轉(zhuǎn)運(yùn)到早期內(nèi)體，并可從早期內(nèi)體中逃逸出來(lái)。抑制劑干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣顯示，干擾巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用，將對(duì)HIV-1進(jìn)入巨噬細(xì)胞產(chǎn)生顯著的影響。上述結(jié)果表明，HIV-1-QD病毒顆粒通過(guò)內(nèi)吞方式進(jìn)入到巨噬細(xì)胞中。

5、r>　　第三，實(shí)時(shí)示蹤病毒囊膜與細(xì)胞內(nèi)體發(fā)生膜融合，釋放病毒核心完成有效進(jìn)入重要事件。對(duì)雙標(biāo)記病毒HIV-1-QD-DiO侵染巨噬細(xì)胞的早期行為進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)示蹤研究，發(fā)現(xiàn)病毒經(jīng)內(nèi)吞進(jìn)入巨噬細(xì)胞后可釋放病毒核心至細(xì)胞胞漿，完成病毒的有效進(jìn)入。結(jié)合對(duì)細(xì)胞內(nèi)體等組分的熒光標(biāo)記，證實(shí)HIV-1病毒粒子通過(guò)其囊膜與巨噬細(xì)胞早期內(nèi)體發(fā)生膜融合而釋放病毒核心至細(xì)胞質(zhì)中，實(shí)現(xiàn)病毒侵染的有效進(jìn)入過(guò)程。藥物抑制實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了HIV-1病毒粒子囊膜與內(nèi)體發(fā)生膜

6、融合這一事件在HIV-1感染巨噬細(xì)胞過(guò)程中具有重要作用。
　　第四，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞肌動(dòng)蛋白對(duì)HIV-1侵染巨噬細(xì)胞具有重要作用。通過(guò)對(duì)HIV-1-QD侵染的巨噬細(xì)胞肌動(dòng)蛋白進(jìn)行鬼筆環(huán)肽熒光染色，以及實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)研究肌動(dòng)蛋白在侵染過(guò)程中與HIV-1-QD的相互作用，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白的動(dòng)態(tài)聚合解聚對(duì)HIV-1進(jìn)入巨噬細(xì)胞、在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)等都具有重要作用。肌動(dòng)蛋白相關(guān)抑制劑可顯著抑制病毒的有效感染。
　　綜上所述，本研究構(gòu)建了病毒衣殼內(nèi)