單抗CD105-生物素-親和素系統(tǒng)篩選滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、第一部分:CD105陽性SMSCs的分離和成軟骨能力評估的實驗研究
　　目的:通過流式細(xì)胞分選方法(Fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)分選出CD105陽性滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(Synovium-derived Mesenchymal Stem Cells，SMSCs);比較CD105陽性SMSCs與CD105陰性SMSCs的成軟骨能力的強(qiáng)弱。
　　方法:獲取人膝關(guān)節(jié)滑膜組織，傳代分

2、離法得到SMSCs，通過FACS分選出CD105陽性SMSCs和CD105陰性SMSCs。而后將實驗分為兩組:CD105陽性SMSCs組、CD105陰性SMSCs組。將細(xì)胞分別種植于12孔板中，在種植后第3天、第7天和第14天進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測（WST-1法）;在種植后第14天行免疫組化染色，RT-qPCR檢測兩組細(xì)胞col2α1、aggrecan、sox9的mRNA表達(dá)水平的差別。
　　結(jié)果:CD105陽性SMSCs和CD10

3、5陰性SMSCs在光鏡下的形態(tài)相似，均呈紡錘形和衛(wèi)星形。CD105陰性SMSCs組細(xì)胞和CD105+SMSCs組細(xì)胞WST-1檢測的od值第3天分別是0.329±0.0120和0.376±0.012，第7天分別是0.524±0.007和0.581±0.009，第14天分別是0.658±0.032和0.702±0.099，三個時間點中兩組數(shù)據(jù)之間均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。第14天時CD105陽性SMSCs組細(xì)胞Ⅱ型膠原的表達(dá)量比CD

4、105陰性SMSCs組細(xì)胞表達(dá)量多，RT-qPCR檢測結(jié)果用2-△△CT值表示，CD105陽性SMSCs組col2α1、sox9、aggrecan的表達(dá)量分別是CD105陰性SMSCs組的2.937±0.899倍、10.676±2.276倍、4.282±0.463倍，均有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:通過FACS分選可以得到CD105陽性SMSCs，CD105陽性SMSCs的成軟骨能力比CD105陰性SMSCs強(qiáng)。

5、>　　第二部分:單抗CD105-ABBS篩選SMSCs的實驗研究
　　目的:評價單抗CD105-生物素-親和素系統(tǒng)(CD105 monoclonal antibody-biotin-avidin system，CD105-ABBS)對CD105陽性SMSCs的篩選價值。
　　方法:實驗分兩組:ABBS（生物素-親和素系統(tǒng)，avidin-biotin system）組和CD105-ABBS組。在細(xì)胞爬片上分別構(gòu)建ABBS和CD

6、105-ABBS，再將構(gòu)建好系統(tǒng)的爬片放入同一個盛有SMSCs懸液的培養(yǎng)皿中，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。30min后將細(xì)胞爬片取出，震蕩洗脫未黏附的細(xì)胞。100倍鏡下隨機(jī)取3處非中心非邊緣的視野，分別計算兩組爬片黏附的細(xì)胞數(shù)量;CD105免疫熒光檢測兩組黏附的細(xì)胞中CD105陽性SMSCs所占比例的差異。將震蕩洗滌后的兩組細(xì)胞爬片放入12孔板中，加入軟骨誘導(dǎo)液進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)，在第3天、第7天、第14天分別進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測（WST-1

7、法）;在種植后第14天行免疫組化染色，RT-qPCR檢測兩組細(xì)胞col2α1、aggrecan、sox9的mRNA表達(dá)水平的差別。
　　結(jié)果:細(xì)胞爬片經(jīng)過震蕩洗滌后，ABBS組爬片和CD105-ABBS組爬片黏附細(xì)胞數(shù)量分別20.33±5.43和40.67±7.54（個/100倍鏡視野），數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);黏附細(xì)胞中CD105陽性SMSCs所占比例為(47.67±7)％和(72.33±11.93)％，數(shù)據(jù)有統(tǒng)計學(xué)差

8、異(P＜0.05)。成軟骨誘導(dǎo)第14天時，免疫組化染色結(jié)果提示CD105-ABBS組Ⅱ型膠原表達(dá)量多于ABBS組;RT-qPCR檢測結(jié)果用2-△△CT值表示，CD105-ABBS組col2α1、sox9、aggrecan等mRNA的表達(dá)量分別是ABBS組的1.835±0.369倍、2.808±0.189倍、3.146±0.552倍，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。
　　結(jié)論:CD105單抗快速、選擇性的吸附增殖成軟骨分化能力強(qiáng)的CD