牛乳中α-乳白蛋白的表位定位研究.pdf

1、乳及乳制品因其豐富的營(yíng)養(yǎng)而深受人們的喜愛(ài),但同時(shí),乳及乳制品又是一類(lèi)常見(jiàn)的食物過(guò)敏原。牛乳過(guò)敏嚴(yán)重影響著部分人群的健康和生活質(zhì)量,流行病學(xué)調(diào)查顯示,2％-2.5％的嬰幼兒和1％左右的成人對(duì)牛乳過(guò)敏。因此,開(kāi)展牛乳過(guò)敏的研究具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　 牛乳α-乳白蛋白屬于溶菌酶家族,是導(dǎo)致牛乳過(guò)敏的主要過(guò)敏原蛋白之一。本研究主要包括牛乳α-乳白蛋白的分離純化,兔抗牛乳α-乳白蛋白多克隆抗體的制備、多克隆抗體的純化及牛乳α-乳

2、白蛋白的線性及構(gòu)象型表位的定位。研究的主要結(jié)果及結(jié)論如下。
　　 1.采用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析及Sephadex G-75凝膠層析從牛乳中分離純化α-乳白蛋白,SDS-PAGE鑒定結(jié)果表明,分離得到了純度達(dá)90％以上的牛乳α-乳白蛋白,回收率為19.42％
　　 2.以純化得到的牛乳α-乳白蛋白免疫日本大白耳兔,制備了兔抗牛乳α-乳白蛋白多克隆抗體,間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表明,兩

3、只兔子所獲血清效價(jià)分別達(dá)1:204,800和1:320,000,抗血清與牛乳中其它蛋白無(wú)免疫交叉反應(yīng),特異性較好。但Western blotting結(jié)果卻顯示與不同來(lái)源的α-乳白蛋白能發(fā)生不同程度的免疫交叉反應(yīng)。
　　 3.利用溴化氰活化的Sepharose4B柱材偶聯(lián)牛乳α-乳白蛋白對(duì)所獲抗血清進(jìn)行親和純化,以3M MgCl2為洗脫液對(duì)抗體進(jìn)行特異性洗脫,濃縮后得到SDS-PAGE純的兔抗牛乳α-乳白蛋白IgG抗體,間接ELI

4、SA結(jié)果表明抗體效價(jià)回收良好。
　　 4.以純化后的特異性兔IgG為靶分子,用噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)及噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫(kù)對(duì)其進(jìn)行淘選,經(jīng)過(guò)4輪的淘選后,隨機(jī)挑選未擴(kuò)增的噬菌體克隆進(jìn)行ELISA鑒定,提取陽(yáng)性克隆DNA,進(jìn)行測(cè)序、分析得到模擬肽序列。隨機(jī)七肽庫(kù)篩選后的模擬肽經(jīng)Clustalx軟件比對(duì)得到牛乳α-乳白蛋白與兔IgG結(jié)合的線性表位區(qū)為AA21-27,AA36-41,AA63-68,AA79-82,AA114-119。借助生物