果汁飲料中過敏原α-乳白蛋白的檢測(cè)研究.pdf

1、牛乳含有豐富的蛋白質(zhì)，深受人們的青睞,尤其對(duì)嬰幼兒和老年人來說，是日常生活中主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來源。但同時(shí)，牛乳又是主要的過敏食物之一。調(diào)查表明,牛乳過敏在人群中的發(fā)病率為0.3-7.5％，其中一歲以下嬰幼兒中的發(fā)病率達(dá)到2-3%。牛乳中α-乳白蛋白屬于溶菌酶家族，是導(dǎo)致牛乳過敏的主要過敏原蛋白之一，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，超過51%的牛乳過敏是由α-乳白蛋白引起的。牛乳中α-乳白蛋白與人乳中α-乳白蛋白的同源性約為74%，另有6%的氨基酸殘基化學(xué)性

2、質(zhì)相似，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、但致敏性強(qiáng)。牛乳常作為原料用于各種食品，最近幾年，牛奶與果汁搭配的果汁奶憑借其口感好、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)而越來越風(fēng)靡，然而我國(guó)對(duì)于果汁飲料中的α-乳白蛋白檢測(cè)基本處于空白階段，所以開展針對(duì)果汁中α-乳白蛋白的檢測(cè)具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。
　　目前對(duì)于過敏原牛α-乳白蛋白檢測(cè)的方法主要有免疫分析法，PCR法以及儀器分析法，在儀器分析法中高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC/MS/MS）具有抗背景干擾和檢測(cè)能力

3、強(qiáng)、靈敏、準(zhǔn)確、檢測(cè)信息豐富等優(yōu)點(diǎn)越來越廣泛的被運(yùn)用于α-乳白蛋白的檢測(cè)。本課題重點(diǎn)開展果汁飲料中牛α-乳白蛋白檢測(cè)方法的研究。目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)集中于奶粉、乳清蛋白粉中過敏原牛α-乳白蛋白的檢測(cè)研究，對(duì)果汁飲料中牛α-乳白蛋白的研究較少，且前處理較為繁瑣，牛α-乳白蛋白回收率不盡理想。本課題建立了基于肽水平的LC/MS/MS法檢測(cè)分析果汁飲料中過敏原牛α-乳白蛋白的方法，取得了一下的研究成果：
　　1、篩選得到了牛α-乳白蛋白標(biāo)簽肽

4、段
　　利用牛胰蛋白酶的特異性酶切將牛α-乳白蛋白分解成許多小肽段，根據(jù)肽段的全掃描圖譜與理論肽譜進(jìn)行匹配挑選出了兩條肽段，對(duì)這兩段肽段進(jìn)行靈敏度比較后再進(jìn)行特異性考證。最后，對(duì)應(yīng)牛α-乳白蛋白99-108氨基酸的肽段VGINYWLAHK因其在質(zhì)譜MRM監(jiān)測(cè)模式分析中具有較高靈敏度，并且是α-乳白蛋白的保守序列具有較強(qiáng)的特異性可以作為牛α-乳白蛋白的標(biāo)簽肽段。
　　2、設(shè)計(jì)合成了檢測(cè)牛α-乳白蛋白標(biāo)簽肽段的內(nèi)標(biāo)肽段
　

5、　在牛α-乳白蛋白標(biāo)簽肽的基礎(chǔ)上取代或者增加一個(gè)氨基酸設(shè)計(jì)合成了兩段肽段VGINWWLAHK和VGINNYWLΑHK。將合成的兩種肽段和牛α-乳白蛋白標(biāo)簽肽的色譜行為和質(zhì)譜行為進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)肽段VGINWWLAHK與牛α-乳白蛋白標(biāo)簽肽的色譜行為和質(zhì)譜行為都比較接近，說明肽段VGINWWLAHK與牛α-乳白蛋白標(biāo)簽肽具有相似的性質(zhì)，可以作為本方法的內(nèi)標(biāo)肽。
　　3、獲得了牛α-乳白蛋白標(biāo)簽肽的檢測(cè)條件：
　　考察了不同的色

6、譜柱、柱溫、流速等色譜參數(shù)和質(zhì)譜參數(shù)，最終得到的檢測(cè)條件為：使用Αgilent mRP-C18柱（50×4.6mm，5μm）為分析柱分離目標(biāo)物質(zhì)，以含0.1%甲酸的乙腈水溶液（98：2，v/v）為流動(dòng)相作梯度洗脫，流速0.6mL/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量：10μL，分析物在電噴霧正離子條件下，采用多離子監(jiān)測(cè)模式，用內(nèi)標(biāo)法定量。
　　4、設(shè)計(jì)合成了檢測(cè)牛α-乳白蛋白標(biāo)簽肽段的內(nèi)標(biāo)物
　　設(shè)計(jì)合成了與牛α-乳白蛋白有相同酶切位

7、點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)物肽段KILDKVGINWWLΑHKΑLCSE使其具有與牛α-乳白蛋白相似的酶解效率，可以作為本研究的內(nèi)標(biāo)物對(duì)整個(gè)方法處理過程進(jìn)行跟蹤考察以消除酶解效率和基質(zhì)效應(yīng)等因素引起的誤差。
　　5、建立了果汁飲料中過敏原牛α-乳白蛋白的檢測(cè)方法
　　確立了方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率、檢出限和精密度等方法學(xué)參數(shù)。方法在0.01～10μM范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999，在0.05，0.1，0.2g/100mL三個(gè)添加水平

8、時(shí)，果汁的平均回收率在97.2%～103.4%之間，RSD在4.1%～6.4%之間。日內(nèi)、日間精密度都低于4.6%。本方法的檢出限和定量限可達(dá)到0.2mg/100m L、0.6mg/100mL，能夠滿足果汁樣品中低含量的牛α-乳白蛋白的檢測(cè)需求。本文建立的果汁飲料中過敏原牛α-乳白蛋白的檢測(cè)方法，定性定量準(zhǔn)確、快捷、抗干擾能力強(qiáng)、靈敏度較高，方法準(zhǔn)確性和重現(xiàn)好。與傳統(tǒng)的液相色譜法相比，本研究不需要牛α-乳白蛋白的純化等繁雜步驟，操作簡(jiǎn)單