牛乳主要過(guò)敏原α-乳白蛋白B細(xì)胞表位的定位.pdf

1、牛乳及乳制品因其含有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而受到廣大消費(fèi)者的青睞，但同時(shí)牛乳及牛乳制品是導(dǎo)致食物過(guò)敏的八大類食物之一，其中α-乳白蛋白是牛乳中的最主要過(guò)敏原之一。食物過(guò)敏反應(yīng)是一種免疫學(xué)變態(tài)反應(yīng)，其反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)是抗原表位與抗體對(duì)位。開展表位定位及特性研究可深入了解α-乳白蛋白致敏的物質(zhì)基礎(chǔ)，有助于更好地認(rèn)識(shí)α-乳白蛋白在乳過(guò)敏反應(yīng)中的作用，為基于表位靶標(biāo)而制備低過(guò)敏乳制品提供理論指導(dǎo)。
　　本課題以牛乳α-乳白蛋白為研究對(duì)象，由親和純化

2、牛乳過(guò)敏患者的特異性IgE和IgG抗體為靶分子，親和淘選噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，最終通過(guò)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器定位出牛乳α-乳白蛋白表位，研究的主要方法、結(jié)果及結(jié)論如下。
　　1.通過(guò)ImmunoCAP，從19位兒童牛乳過(guò)敏患者血清中篩選出8個(gè)抗牛乳α-乳白蛋白的S-IgE值大于0.35 kUA/l的患者血清，并等體積混合得血清池。利用Sepharose4B免疫層析柱和Protein G免疫層析柱兩步法純化抗牛乳α-乳白蛋白特異性IgG和IgE抗體，

3、經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果表明制備的抗牛乳α-乳白蛋白人血清IgG和IgE純度分別為93.8％和85.3%。
　　2.以特異性IgE和 IgG抗體為靶分子，分別對(duì)噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫(kù)和十二肽庫(kù)進(jìn)行親和淘選，并從第三輪中隨機(jī)挑選48個(gè)克隆子，采用ELISA進(jìn)行陽(yáng)性鑒定，通過(guò)DNA測(cè)序得到模擬肽氨基酸序列，由此獲得抗牛乳α-乳白蛋白B細(xì)胞結(jié)合的線性和構(gòu)象性模擬表位肽。
　　3.借助UniProt軟件，將線性表位模擬肽與牛乳α-

4、乳白蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，依據(jù)氨基酸的基本性質(zhì)，定位出七個(gè)IgE和六個(gè)IgG線性結(jié)合表位。其中IgE線性表位序列為AA41-46，AA55-60，AA62-72，AA74-76，AA85-90和AA92-99， IgG線性表位序列為AA37-46，AA52-54，AA56-59，AA63-72，AA74-76，AA81-90和 AA92-99。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，組成牛乳α-乳白蛋白線性表位的主要氨基酸為天冬氨酸和賴氨酸，其次為天冬酰胺，異亮氨酸

5、和谷氨酰胺。
　　4.通過(guò)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，將環(huán)七肽庫(kù)得到的模擬肽與牛乳α-乳白蛋白進(jìn)行空間模擬、計(jì)算及優(yōu)化，定位出六個(gè)IgE和三個(gè)IgG結(jié)合的構(gòu)象性表位。其中IgE構(gòu)象性表位的序列分別為 K62-N71-I75-S76-K79， K62-I75-S76-K79-L81， P24-E25-K114-L115-Q117-L119， L105-H107-K108-L110， V42-Q43-S47-T48-Q65-P67和N44-S47-T