豬帶絳蟲(chóng)乳酸脫氫酶A(Ts LDHA)和B(Ts LDHB)基因克隆表達(dá)、免疫學(xué)特性分析及亞細(xì)胞定位.pdf

1、目的:從豬帶絳蟲(chóng)（Taenia solium）成蟲(chóng)cDNA文庫(kù)中篩選出乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A，LDH-A）和乳酸脫氫酶B(lactate dehydrogenaseB，LDH-B)的同源序列，分析和預(yù)測(cè)兩者編碼蛋白的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，并對(duì)其進(jìn)行克隆表達(dá)、免疫學(xué)特性分析及亞細(xì)胞定位研究。
　　方法:通過(guò)生物信息學(xué)方法從豬帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)全長(zhǎng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)中識(shí)別豬帶絳蟲(chóng)乳酸脫氫酶A（TsLDH-A)和

2、乳酸脫氫酶B（TsLDH-B）基因及其編碼區(qū)，利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)、瑞士生物信息學(xué)研究所的蛋白分析專(zhuān)家系統(tǒng)(ExPASy)和免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)分析資源（IEDB Analysis Recource）中有關(guān)的生物信息學(xué)分析工具，結(jié)合其它生物信息學(xué)分析軟件包，預(yù)測(cè)、分析兩基因編碼的蛋白的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能。將兩基因克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)中，在大腸桿菌BL-21/DE3中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后用以免疫SD大鼠

3、制備免疫血清，ELISA檢測(cè)抗體滴度。用蛋白印跡(Western Blotting)方法分析純化的重組蛋白的初步免疫學(xué)特性，免疫熒光組織定位方法檢測(cè)目的蛋白在成蟲(chóng)的定位。以PEGFP-N1為載體構(gòu)建真核表達(dá)體系并轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，RT-PCR及WesternBlotting方法鑒定目的基因在所轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞的表達(dá)，GFP示蹤及細(xì)胞免疫熒光方法觀察目的蛋白在Hela細(xì)胞的定位。
　　結(jié)果:兩序列都是包含完整開(kāi)放閱讀框的全長(zhǎng)基因，

4、推導(dǎo)出的氨基酸序列與GenBank中其它物種LDH-A或LDH-B同源基因氨基酸序列的一致性均超過(guò)50％。兩者編碼的蛋白在氨基酸數(shù)目(331)、較穩(wěn)定的蛋白理化性質(zhì)、L-乳酸脫氫酶結(jié)構(gòu)域、構(gòu)成LDH酶催化中心的關(guān)鍵氨基酸、包含LDH活性位點(diǎn)的B細(xì)胞線性表位、無(wú)亞細(xì)胞定位等方面是一致的，但兩者在翻譯后的修飾位點(diǎn)、3個(gè)跨膜區(qū)和其他線性表位方面既相似也有區(qū)別。PCR、雙酶切及DNA測(cè)序結(jié)果均表明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-Ts LDH-A和

5、pET-28a(+)-Ts LDH-B構(gòu)建成功。SDS-PAGE結(jié)果表明目的基因在大腸桿菌BL-21/DE3中獲得可溶性表達(dá)，經(jīng)親和層析獲得了高純度蛋白。重組蛋白可被其免疫的SD大鼠血清識(shí)別，具有免疫原性;同時(shí)重組蛋白也能被豬帶絳蟲(chóng)病患者血清及感染豬帶絳蟲(chóng)囊尾蚴的豬血清識(shí)別，具有較好的免疫反應(yīng)性。兩重組蛋白均能被牛帶絳蟲(chóng)患者血清、亞洲帶絳蟲(chóng)患者血清、華枝睪吸蟲(chóng)患者血清及血吸蟲(chóng)患者血清所識(shí)別。免疫熒光組織定位結(jié)果顯示Ts LDH-A和Ts

6、 LDH-B分布于豬帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)的表膜。成功構(gòu)建了目的基因的真核表達(dá)系統(tǒng)，GFP示蹤及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示GFP-Ts LDH-A和GFP-Ts LDH-B融合蛋白在轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞膜上表達(dá)和定位。
　　結(jié)論:豬帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)同時(shí)表達(dá)A、B兩種L-乳酸脫氫酶。Ts LDH-A和Ts LDH-B具有較好的抗原性，并與其他蠕蟲(chóng)的感染血清存在著交叉反應(yīng)，不適宜做囊蟲(chóng)病的診斷抗原。Ts LDH-A和Ts LDH-B具有跨膜區(qū)，定位于成蟲(chóng)皮層，