CCN1-Cyr61在肝硬化-肝癌進程中的作用和機制研究.pdf

1、目的:
　　肝星狀細胞(hepaticstellatecell,HSC)是肝纖維化過程中成纖維細胞的主要來源,肝星狀細胞被激活而轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞并分泌細胞外基質(zhì)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié);另外,活化的肝星狀細胞可以促進肝癌細胞生長、遷移和活力,而肝癌細胞反過來也可以促進肝星狀細胞的增殖、遷移、分泌纖維化因子及增強促血管生成的活性,二者相互作用的惡性循環(huán),促進了肝癌的發(fā)展。CCN1即富半胱氨酸61(cysteinerich6

2、1,Cyr61),是CCN家族成員之一,是一種重要的細胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)因子,通過作用于成纖維細胞,在皮膚創(chuàng)傷-愈合過程中起重要作用。肝臟疾病中,CCN1促進了非酒精脂肪性肝炎中巨噬細胞的浸潤和肝癌細胞的增殖與遷移,在癌周肝硬化和良性肝硬化組織中CCN1呈高表達,而肝星狀細胞膜上高表達CCN1的受體—整合素,提示CCN1可以作用于肝星狀細胞,但作用機制尚不清楚。本研究通過建立肝纖維化動物模型,并結(jié)合細胞共培養(yǎng)和裸鼠皮下瘤等實驗,證明如下假設(shè):

3、CCN1在肝纖維化-肝硬化發(fā)展進程中呈動態(tài)表達,其表達水平與肝纖維化的發(fā)展進程相關(guān);CCN1參與促進肝星狀細胞的活化;肝纖維化-肝硬化-肝癌進程中高表達的CCN1增強了肝星狀細胞的促癌作用,最終揭示CCN1在肝硬化-肝癌發(fā)生進程中的作用和機制。
　　方法:
　　1.CCN1在肝纖維化-肝硬化-肝癌疾病進程中表達的研究
　　1.1.檢測分析人肝硬化病例組織標本中CCN1蛋白的表達及定位。
　　1.1.1.應用免疫組

4、化染色法檢測32例良性肝硬化組織、30例癌周肝硬化組織和5例正常成人肝臟組織CCN1蛋白的表達情況。
　　1.1.2.應用免疫熒光染色法(CCN1和α-SMA雙標)檢測肝硬化病例組織標本中CCN1蛋白的表達定位情況。
　　1.2.肝纖維化動物模型中動態(tài)觀察CCN1蛋白在肝纖維化發(fā)生、發(fā)展進程的表達規(guī)律及定位情況。
　　1.2.1.四氯化碳(CCL4)誘導法制作肝纖維化小鼠模型,在制作過程中應用HE染色、SIRIUSRE

5、D染色、免疫組織化學染色和Western-blot等方法,動態(tài)觀察肝臟病變程度、膠原纖維生成情況及肝組織中CCN1蛋白的表達情況。
　　1.2.2.肝纖維化小鼠模型成型后停止注射四氯化碳,應用HE染色、SIRIUSRED染色、免疫組織化學染色和Western-blot等方法,觀察肝纖維化病情變化與CCN1蛋白表達變化情況。
　　1.2.3.免疫熒光染色法(CCN1和α-SMA雙標),分析CCN1蛋白的表達定位情況。1.3We

6、stern-blot檢測人和大鼠肝星狀細胞株中CCN1蛋白的表達情況。
　　2.CCN1在體外促進肝星狀細胞活化作用的研究
　　2.1.以HEK293細胞擴增重組腺病毒AdCCN1和AdRFP,體外檢測病毒感染滴度。
　　2.2.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細胞,熒光顯微鏡觀察細胞熒光表達情
　　況,Western-blot檢測肝星狀細胞中CCN1表達情況,應用MTT方法檢測肝星狀細胞的增殖能力,We

7、stern-blot方法檢測肝星狀細胞中α-SMA蛋白和Ⅰ型膠原表達情況。
　　2.3.CCN1通過整合素αv調(diào)控肝星狀細胞活化的研究。分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細胞,12小時后加入整合素αv的抗體,應用MTT方法檢測肝星狀細胞的增殖能力,Western-blot檢測肝星狀細胞中CCN1、α-SMA蛋白和Ⅰ型膠原表達情況。
　　3.CCN1增強肝星狀細胞促癌作用的研究
　　3.1.CCN1增強肝星狀細胞促

8、進肝癌細胞增殖作用的研究。
　　3.1.1.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細胞Lx-2,收集其條件培養(yǎng)液,并用以處理肝癌細胞HepG2,并應用MTT方法檢測HepG2細胞的增殖能力。
　　3.1.2.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細胞Lx-2,并與HepG2細胞共培養(yǎng),5天后將HepG2細胞進行結(jié)晶紫染色,觀察其克隆形成的情況。
　　3.1.3.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細胞Lx-2,

9、收集其條件培養(yǎng)液,并用以處理肝癌細胞HepG2,Western-blot檢測HepG2細胞中腫瘤相關(guān)信號分子的表達情況。
　　3.2.CCN1增強肝星狀細胞促進肝癌細胞遷移和侵襲作用的研究。
　　3.2.1.分別用AdCCN1或AdRFP肝星狀細胞Lx-2,收集其條件培養(yǎng)液,并用以處理肝癌細胞HepG2,應用劃痕-愈合實驗、Transwell遷移實驗和Transwell侵襲實驗檢測HepG2細胞遷移和侵襲能力。
　　3

10、.2.2.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細胞Lx-2,收集其條件培養(yǎng)液,并用以處理肝癌細胞HepG2,Western-blot檢測HepG2細胞中侵襲相關(guān)信號分子的表達情況。
　　3.3.體內(nèi)研究CCN1增強肝星狀細胞的促癌作用。
　　3.3.1.分別用AdCCN1或AdRFP感染肝星狀細胞LX-2,得到LX-2-CCN1和LX-2-RFP細胞,分別將HepG2、LX-2、HepG2+LX-2、HepG2+LX-2

11、-RFP和HepG2+LX-2-CCN1五組細胞注入裸鼠皮下。
　　3.3.2.動態(tài)檢測各組皮下瘤生長情況,26天后處死裸鼠收集皮下瘤,制作石蠟切片,并提取皮下瘤組織總蛋白。
　　3.3.3.皮下瘤石蠟切片進行HE染色,觀察組織形態(tài)。
　　3.3.4.皮下瘤石蠟切片進行SIRIUSRED染色,觀察瘤組織中膠原纖維生成的情況。3.3.5.皮下瘤石蠟切片進行免疫組化染色,檢測瘤組織中Ki67表達情況。
　　3.3.6

12、.皮下瘤石蠟切片進行免疫組化和免疫熒光染色—CD31,檢測瘤組織中微血管的生成情況,Western-blot檢測皮下瘤組織中VEGF蛋白表達情況。
　　結(jié)果:
　　1.臨床病例檢測發(fā)現(xiàn),肝硬化和肝癌癌周肝硬化組織中CCN1呈高表達,主要表達于肝實質(zhì)細胞中,間質(zhì)散在表達,正常成人肝臟組織不表達CCN1,病例組織中活化的肝星狀細胞中未檢測到CCN1表達。
　　2.肝纖維化動物模型中發(fā)現(xiàn),肝纖維化發(fā)展進程中CCN1表達增高,

13、并隨病情發(fā)展呈動態(tài)變化:CCL4持續(xù)作用——病情持續(xù)加重——CCN1逐漸升高;停止CCL4作用—病情持續(xù)減輕—CCN1持續(xù)降低,而肝纖維化小鼠肝臟中活化的肝星狀細胞中檢測到CCN1表達。
　　3.體外檢測發(fā)現(xiàn),人肝星狀細胞株LX-2中不表達CCN1蛋白,而大鼠肝星狀細胞株T6中CCN1呈弱表達,與臨床標本和動物模型的研究結(jié)果一致。
　　4.CCN1促進了肝星狀細胞LX-2和T6的增殖能力,并且上調(diào)了兩種細胞CollagenⅠ

14、及α-SMA蛋白的表達。
　　5.阻斷LX-2細胞膜上的整合素αv,抑制了CCN1促進LX-2細胞增殖和表達CollagenⅠ及α-SMA蛋白的能力。
　　6.體外研究結(jié)果顯示,CCN1作用于肝星狀細胞LX-2,增強了其促進肝癌細胞HepG2增殖的作用,并使HepG2細胞中β-catenin信號通路的活性增強,并使下游基因cyclineD1、c-myc、survivin及CD34等癌基因或腫瘤相關(guān)因子表達增高。
　　7

15、.體外研究結(jié)果顯示,CCN1作用于肝星狀細胞LX-2,增強了其促進肝癌細胞HepG2遷移及侵襲的作用,并使HepG2細胞中侵襲相關(guān)信號通路活性蛋白p-ERK1/2和下游效應蛋白MMP-9表達增高,同時細胞粘附相關(guān)蛋白E-cadherin的表達降低。
　　8.裸鼠皮下瘤實驗結(jié)果顯示,LX-2細胞單獨注入裸鼠皮下后不能形成皮下瘤,而其余四組細胞注入裸鼠皮下后均形成皮下瘤,其中HepG2+LX-2-CCN1組的皮下瘤生長最快。
　

16、　9.和對照組相比,HepG2+LX-2-CCN1組的皮下瘤組織結(jié)構(gòu)較復雜,瘤細胞排列較混亂,纖維結(jié)締組織大量增生,細胞呈多形性,組織間有炎細胞浸潤。
　　10.和對照組相比,HepG2+LX-2-CCN1組的皮下瘤組織中膠原纖維生成的量較多,同時其Ki67陽性細胞數(shù)量較多及染色程度較強。
　　11.和對照組相比,HepG2+LX-2-CCN1組的皮下瘤組織中微血管的數(shù)量最多;Western-blot結(jié)果顯示,HepG2+L

17、X-2-CCN1組的皮下瘤組織中VEGF蛋白表達量最高。
　　結(jié)論:
　　1.臨床病例檢測發(fā)現(xiàn),良性肝硬化和肝癌癌周肝硬化組織中,CCN1在肝實質(zhì)細胞中高表達;而在鼠肝纖維化模型,CCN1隨肝纖維化發(fā)展過程呈動態(tài)變化,提示CCN1可能在肝纖維化-肝硬化發(fā)展過程中發(fā)揮一定作用。
　　人和鼠肝星狀細胞中CCN1的表達情況表明,CCN1在人和鼠肝纖維化疾病病理過程中的作用機制可能有所不同。
　　2.過表達CCN1促進了

18、肝星狀細胞株LX-2和T6的增殖,并且上調(diào)了兩種細胞中collagenⅠ及α-SMA蛋白的表達,提示肝纖維化-肝癌進程中,高表達的CCN1可以參與肝星狀細胞的活化;阻斷LX-2細胞膜上的整合素αv可以抑制CCN1促進肝星狀細胞活化的作用,表明CCN1通過與受體整合素αv結(jié)合而促進肝星狀細胞活化。
　　3.CCN1作用于肝星狀細胞LX-2,增強了LX-2細胞促進肝癌細胞HepG2增殖、遷移及侵襲的能力,同時提高了其促進HepG2細胞