Cyr61-CCN1在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及作用機(jī)制初步研究.pdf

1、目的： 富半胱氨酸蛋白61(Cysteine rich61，Cyr61)是CCN(Cyr61、CTGF、NOV)蛋白家族成員之一，為即刻早期基因，是重要的細(xì)胞基質(zhì)調(diào)節(jié)因子。Cyr61具有明顯的促有絲分裂活性和趨化性，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、粘附，并和血管形成相關(guān)。Cyr61在腫瘤中表現(xiàn)的生物學(xué)功能是多樣的，在不同的腫瘤組織細(xì)胞中，Cyr61的表達(dá)水平和功能不同。但是目前，Cyr61與腫瘤的確切關(guān)系及其機(jī)理尚不清楚。本研究首先分

2、析了Cyr61在肝細(xì)胞癌(Human Hepatocellular Carcinoma，HCC)、癌周肝硬化、癌旁、正常肝臟組織中的表達(dá)，并同時(shí)分析了VEGF在HCC、癌周肝硬化組織中表達(dá)及其與Cyr61的相關(guān)性，探討Cyr61在肝癌發(fā)生過(guò)程中的作用，進(jìn)而以肝癌細(xì)胞株HepG2為模型，研究過(guò)表達(dá)外源性Cyr61對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移的影響，為進(jìn)一步揭示Cyr61在肝癌發(fā)生中的作用和機(jī)制奠定基礎(chǔ)，對(duì)尋找腫瘤診斷與治療的新標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)具有

3、重要意義。 方法： 1.采用免疫組化SP染色法檢測(cè)5例正常成年人肝臟組織和35例HCC患者組織中Cyr61蛋白表達(dá)水平，半定量分析其表達(dá)與HCC的臨床病理學(xué)特征的關(guān)系。 2.采用Western blot的方法定量分析正常成人肝臟組織、HCC患者組織及與其配對(duì)的癌旁組織中Cyr61蛋白表達(dá)的差異。 3.采用RT-PCR的方法檢測(cè)30例患者HCC組織及與其配對(duì)的癌旁組織中Cyr61的表達(dá)，半定量分析HCC組織

4、和癌旁組織Cyr61 mRNA表達(dá)量的差異。 4.采用免疫組化SP法，共檢測(cè)58例HCC及癌周肝硬化組織中Cyr61和VEGF蛋白的表達(dá)，半定量分析28例HCC患者組織中Cyr61和VEGF蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，并分析Cyr61蛋白與VEGF蛋白表達(dá)在HCC發(fā)生過(guò)程中的相關(guān)性及對(duì)HCC血管生成的作用。 5.應(yīng)用293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒Ad-Cyr61、Ad-RFP，并進(jìn)行滴度測(cè)定及細(xì)胞感染，獲得瞬時(shí)高表達(dá)Cyr6

5、1的Cyr61-HepG2細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞RFP-HepG20 6.RT-PCR、免疫組化SP染色法和Western blot分別檢測(cè)Cyr61-HepG2細(xì)胞，RFP-HepG2細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中Cyr61的mRNA和蛋白的表達(dá)。 7.MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)、結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，觀察Cyr61對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞增殖和遷移的影響。 結(jié)果： 1.高分化HCC組織的Cyr

6、61蛋白表達(dá)水平高于低分化HCC組織(P<0.01)；鏡下存在靜脈浸潤(rùn)、多結(jié)節(jié)的HCC組織中Cyr61蛋白表達(dá)高于無(wú)靜脈浸潤(rùn)、單結(jié)節(jié)的HCC組織(P<0.05)。 2.正常成人肝組織未見(jiàn)Cyr61蛋白的表達(dá)，癌旁肝組織Cyr61蛋白的表達(dá)明顯高于相應(yīng)HCC組織(P<0.05)。 3.30例肝癌組織Cyr61 mRNA表達(dá)均為陽(yáng)性，HCC組織Cyr61 mRNA表達(dá)低于相應(yīng)癌旁組織(P<0.05)。正常成人肝組織Cyr61

7、 mRNA表達(dá)和癌組織的表達(dá)量無(wú)差異，低于癌旁組織Cyr61mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。 4.Cyr61、VEGF在癌周肝硬化組織中的表達(dá)均高于HCC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；Cyr61、VEGF蛋白的表達(dá)均與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)；相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示Cyr61和VEGF在HCC組織、癌周肝硬化組織中有相關(guān)性(r=0.444，P<0.01)。 5.Ad-Cyr61感染人肝癌細(xì)胞株HepG2，與

8、對(duì)照組比較細(xì)胞數(shù)量增多，集落形成增加，細(xì)胞劃痕逐漸愈合。 結(jié)論： 1.Cyr61在HCC及其癌周組織的蛋白和mRNA的表達(dá)及和臨床病理特征參數(shù)之間的關(guān)系，提示Cyr61可能在肝癌的發(fā)生早期發(fā)揮重要作用，并與肝癌進(jìn)程中的間質(zhì)重建和侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。 2.Cyr61和VEGF在HCC和癌周肝硬化組織中表達(dá)的高度相關(guān)性，提示Cyr61、VEGF異常表達(dá)與肝硬化肝癌的發(fā)展密切相關(guān)，在肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化和腫瘤血管生成過(guò)程中發(fā)揮重