血管內(nèi)皮生長因子基因轉(zhuǎn)染促進(jìn)組織工程血管化和骨折愈合的實驗研究.pdf

1、組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)原理，對病損組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)與重建進(jìn)行研究開發(fā)的一門新興學(xué)科。然而，如何使重建或再生的組織內(nèi)部獲得血供而保證其正常的生長代謝，是在實現(xiàn)組織工程化組織或器官行使功能之前必須解決的一個關(guān)鍵性問題。 就血管再生和血循環(huán)重建而言，血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，無疑是血管形成最重要的調(diào)節(jié)因子。同時VEGF對骨折

2、愈合過程中的血管增生也發(fā)揮著重要作用，骨折部位所表達(dá)的VEGF通過作用于成骨細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)的血管內(nèi)皮生長因子受體1，使成骨細(xì)胞發(fā)生趨化作用而加速骨折的愈合。 基因治療是將外源基因?qū)肽康募?xì)胞，并在體內(nèi)有效表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)和治療作用。研究發(fā)現(xiàn)將VEGF基因?qū)塍w內(nèi)后，其有效表達(dá)所合成的VEGF可以激活血管形成的一系列反應(yīng)，從而達(dá)到血管再生和血循環(huán)重建以及促進(jìn)骨愈合和骨修復(fù)的目的。 基于以上理論依據(jù)，本研究將含有VEG

3、F基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入骨組織工程的種子細(xì)胞中，然后將攜帶有VEGF基因的種子細(xì)胞與支架材料復(fù)合后植入體內(nèi)，觀察組織工程化組織在體內(nèi)的血管再生和血循環(huán)重建情況。本研究同時還進(jìn)行了重組腺病毒載體介導(dǎo)的VEGF基因?qū)氪龠M(jìn)骨折愈合的動物實驗，對體外基因?qū)牒腕w內(nèi)基因?qū)雰煞N模式的效果進(jìn)行了比較。因此，本研究將為深入開展VEGF基因治療促進(jìn)組織工程血管化和骨折愈合提供強(qiáng)有力的實驗依據(jù)。 1重組人VEGF165腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建實驗通過應(yīng)

4、用重組腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)，以細(xì)菌內(nèi)質(zhì)粒間同源重組法構(gòu)建復(fù)制缺陷型重組腺病毒載體。首先將VEGF165cDNA亞克隆到穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)酶切線性化后，與pAdEasy1質(zhì)粒在大腸桿菌BJ5183中進(jìn)行同源重組，重組的病毒質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝擴(kuò)增。通過RT-PCR方法檢測重組腺病毒轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞中VEGF165的轉(zhuǎn)錄。本實驗成功獲得重組腺病毒載體AdGFP/hVEGF165，經(jīng)PCR鑒定，重組腺

5、病毒轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細(xì)胞擴(kuò)增出相應(yīng)的片段。重組腺病毒載體中含有GFP的標(biāo)記基因可以直觀檢測靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染和外源基因的表達(dá)情況。 2人VEGF165基因轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨骼肌成肌細(xì)胞的實驗研究為了比較腺病毒載體和真核表達(dá)質(zhì)粒對大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞和骨骼肌成肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，探討對以上兩種細(xì)胞進(jìn)行重組人VEGF165基因轉(zhuǎn)染的可行性和最佳方法。實驗采用全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法獲得穩(wěn)定的大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bonemarrowstromalce

6、lls，BMSCs)，通過組織塊法分離培養(yǎng)大鼠的骨骼肌成肌細(xì)胞(myoblasts，MBs)。真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-VEGF165分別在陽離子脂質(zhì)體以及新型的陽離子聚合物的介導(dǎo)下對BMSCs和MBs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，重組腺病毒載體AdGFP/hVEGF165也以BMSCs和MBs為靶細(xì)胞行體外轉(zhuǎn)染。通過免疫組織化學(xué)檢測VEGF的表達(dá)。同時通過觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)進(jìn)一步對各種方法的轉(zhuǎn)染效率進(jìn)行比較。研究結(jié)果表明真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.

7、1-VEGF165和重組腺病毒載體AdGFP/hVEGF165均可以成功地在骨髓基質(zhì)細(xì)胞及骨骼肌成肌細(xì)胞中表達(dá)目的基因，而重組腺病毒可高效的轉(zhuǎn)染上述兩種細(xì)胞。 3、重組腺病毒載體介導(dǎo)的VEGF165基因促進(jìn)骨組織工程血管化的實驗研究本研究將通過重組腺病毒載體介導(dǎo)以基因轉(zhuǎn)染的方法使骨組織工程的種子細(xì)胞表達(dá)外源性的VEGF，進(jìn)一步將其與支架材料復(fù)合后植入動物體內(nèi)。放射性核素顯像和組織學(xué)檢測都顯示實驗組的異位成骨能力和再血管化程度均顯

8、著地高于對照組。本實驗表明VEGF基因轉(zhuǎn)染有利于骨組織工程中新骨形成和再血管化。 4、血管內(nèi)皮生長因子體內(nèi)外基因?qū)氪龠M(jìn)大鼠骨折愈合的比較研究本實驗在建立SD大鼠脛骨骨折模型的基礎(chǔ)上，將重組腺病毒載體AdGFP/hVEGF165直接注射或經(jīng)AdGFP/hVEGF165轉(zhuǎn)染大鼠的骨髓基質(zhì)細(xì)胞與藻酸鈣復(fù)合后植入于骨折斷端的骨膜下，同時設(shè)立空載體治療組和未治療組作為對照。于術(shù)后14天、28天，通過影像學(xué)分析和組織學(xué)檢測，比較和評價體外

9、基因?qū)牒腕w內(nèi)基因?qū)雰煞N模式對促進(jìn)骨愈合的治療效果。研究發(fā)現(xiàn)外源性VEGF基因?qū)肟梢源龠M(jìn)新骨的形成，加速骨折的愈合。體內(nèi)基因?qū)牒腕w外基因?qū)雰煞N治療方式，就新骨形成和骨折愈合方面無明顯差異。 綜上所述：本研究構(gòu)建了重組人的VEGF腺病毒表達(dá)載體，并可以高效的轉(zhuǎn)染大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞。通過將基因工程和組織工程有機(jī)地結(jié)合可以促進(jìn)骨組織工程的血管化。外源性VEGF基因?qū)刖哂写龠M(jìn)骨折的愈合的作用，可以通過體內(nèi)基因?qū)牒腕w外基因?qū)雰?/p>