端粒酶在腎臟的表達及其在腎臟缺血再灌注損傷修復過程中的作用研究.pdf

1、目的：端粒酶可以維持端粒體長度，防止細胞衰老，在胚胎干細胞中高度表達，但除部分成體干細胞(如造血干細胞)外，成年體細胞內(nèi)幾乎已無端粒酶的表達。我們利用已報道的端粒酶基因啟動的GFP轉基因鼠(mTert-GFP)研究端粒酶陽性細胞在腎臟的表達和腎損傷后變化，并求證端粒酶陽性表達能否成為腎臟成體干細胞的標志，進一步明確急性腎損傷修復的機制，以尋求指導急性腎損傷治療的理論基礎。
　　 方法：(一)利用mTert-GFP轉基因小鼠，通過

2、腎小管標記物(AQP1、AQP2、THP、DBA及NKCC2等)和腎間質細胞標志物(F4/80、CD31、NG2及PDGFR-beta等)熒光共染定位端粒酶陽性細胞(GFP+)；通過real-time PCR和TRAP(Telomeric Repeat Amplification Protocol)PCR Elisa定量檢測端粒酶基因和酶活性；(二)給新生mTert-GFP小鼠腹腔注射BrdU標記S期細胞，待8周成年后處死，仍保留Brd

3、U標記的細胞為進入緩慢細胞周期的細胞Label-retaining Cells(LRC)，觀察并計數(shù)；(三)10周齡雄性FVB小鼠24只，夾閉雙側腎動脈30min，再通，制作小鼠雙側腎動脈缺血再灌注損傷(I/R)模型，分為假手術組(sham)、術后1天、2天、3天共4組，每組6只，分別取腎標本，同樣用PCR和TRAP法檢測腎損傷修復過程中端粒酶基因和酶活性的變化；(四)利用mTert-GFP轉基因小鼠，建立單側腎臟I/R模型，并在術后腎

4、損傷再修復過程中不同時間點觀察mTert-GFP再生情況；(五)利用mTert-CreERt2；R26LacZ兩種轉基因小鼠，通過譜系追蹤和細胞周期標記研究腎缺血再灌注損傷修復過程中mTert細胞的再生和遷移。
　　 結果：(一)生理狀態(tài)下，端粒酶基因主要表達在成年小鼠腎臟乳頭和內(nèi)髓部位，保持較高的酶活性。成年mTert-GFP轉基因小鼠的腎臟mTert表達與GFP保持一致，端粒酶主要表達于集合管和髓袢的小管上皮細胞(即AQP1

5、、AQP2、THP、NKCC2陽性的小管)，而在近曲小管和間質沒有表達。(二)觀察BrdU標記的腎乳頭，16.7％的細胞長期保留BrdU標記，僅5％GFP+細胞仍有BrdU標記，視為進入慢細胞周期的LRC，這些細胞也散在分布于集合管和髓袢。(三)mTert基因于腎損傷后48h在腎乳頭的表達明顯上調(diào)，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但在髓質和皮質的表達無顯著變化。雙側腎損傷后24h和48h，腎乳頭處端粒酶活性也顯著升高，有統(tǒng)計學意義(P<0

6、.05)。(四)為證明急性腎損傷后端粒酶陽性細胞的作用，IRI刺激后24h、48h和72h分別給予BrdU，發(fā)現(xiàn)僅0.3％-0.5％的GFP+細胞增殖，且損傷最嚴重的外髓和皮質未出現(xiàn)GFP+細胞顯著增加。(五)為追蹤mTert+上皮細胞在I/R后的命運，術前一周給成年mTert-CreERt2；R26LacZ鼠單劑tamoxifen，術后連續(xù)5天給予BrdU，發(fā)現(xiàn)mTert-LacZ細胞未出現(xiàn)明顯增殖和遷移，mTert+細胞也并未標記B