中藥體外致突變性高通量檢測方法的探索.pdf

1、在細菌抗藥性成為全球性難題之際,中藥成為后抗生素時代解決細菌抗藥性的重要資源,不僅成為中國中長期科技發(fā)展綱要中的主要內(nèi)容之一,也引起世界范圍內(nèi)的廣泛關注。因而,中藥的安全性也受到越來越多的關注。
　　鑒于中藥的使用方法目前仍然主要沿用中醫(yī)師藥方(多種中藥飲片的組合)—水煎液口服的服用模式,因此要關注中藥的安全性,首先要關注中藥飲片的安全性,其次才是復配過程的安全性。盡管中藥的使用具有悠久的歷史,但是目前國內(nèi)尚沒有完善的中藥飲片安全

2、性數(shù)據(jù)庫,因而建立類似的數(shù)據(jù)庫就顯得尤為重要。因此,本課題從如何修正和建立適合中藥飲片的體外致突變檢驗的方法入手,利用微生物檢測的方法對中藥遺傳毒理學尤其是體外致突變性進行初步的評價,希望逐步建立常用中藥飲片和復方的體外致突變性數(shù)據(jù)庫,為中藥的安全性提供參考數(shù)據(jù)。
　　藥品的安全性評價程序包括急性毒性檢測、遺傳毒性檢測(包括致突變性)、亞慢性毒性和慢性毒性檢測四個階段。之所以要對中藥的體外致突變性進行檢測,是因為體外致突變性檢測是

3、唯一能用微生物手段進行檢測的指標,而且有大量的數(shù)據(jù)表明,待測物的致突變性和致癌性之間存在一定的相關性。因此,致突變性檢驗成為國際上公認的致畸和致癌檢驗的初篩方法。針對中藥的特殊性質(zhì),做了如下工作:
　　1.體外致突變檢測的方法有很多,其中最經(jīng)典也是最為常用的是細菌回復突變實驗(Ames試驗),該方法在檢測中藥體外致突變過程中存在一些不足之處,比如檢測結果會受樣品中組氨酸成分的影響等。針對中藥的特殊性本實驗室對Ames試驗進行了修正

4、,通過添加過量的組氨酸以掩蓋樣品中微量組氨酸帶來的影響,并用預培養(yǎng)的方法替代平板摻入法,簡化了操作,修正后的Ames試驗克服了中藥中組氨酸成分的影響。國家標準采用統(tǒng)一的預培養(yǎng)時間且處理時間短(90min),事實上不同的待測物可能需要的預培養(yǎng)時間不一樣,因此需要找到一個合適的預培養(yǎng)時間,能夠使不同待測物的致突變性充分發(fā)揮出來。此外,Ames試驗操作復雜,不適合對大量中藥進行快速的評價,因此本課題的主要內(nèi)容是尋找高通量的體外致突變檢測方法以

5、替代經(jīng)典Ames試驗。之所以對Ames試驗進行修正,是因為該方法具有可參考的標準,能夠作為其他方法的一個參考。
　　2.從上世紀80年代開始,經(jīng)典Ames試驗的替代方法層出不窮,這其中應用最多也是和Ames試驗結果符合度最高的是基于SOS反應的umu-lacZ體系。當檢測菌株受到誘變劑作用后會啟動SOS反應,umuDC基因表達上調(diào),通過檢測β-半乳糖苷酶的酶活就可以檢測樣品誘變性的強弱。目前,該方法被廣泛用于飲用水和污水的致突變檢

6、測,并已制定了國際標準。該方法需要檢測酶活,盡管可以高通量進行,但是為了簡化操作并排除中藥藥液的顏色對酶活檢測的影響,嘗試將報告基因lacZ替換為EGFP,構建了umu-EGFP體系,經(jīng)過驗證,該體系檢測靈敏度太低,不適合中藥體外致突變檢測;
　　3.為了提高檢測的靈敏度,將umuDC基因啟動子替換為recA基因的啟動子,構建了rec-EGFP體系,經(jīng)過陽性誘變劑的驗證該體系可用于體外致突變檢測。通過與umu-lacZ體系以及之前

7、的染色體畸變結果比較發(fā)現(xiàn),rec-EGFP體系在中藥的檢測中表現(xiàn)出了較高的陽性率,但該體系在陽性誘變劑的檢測中表現(xiàn)正常,其中的原因有待深入研究。
　　4.考慮到umu-lacZ體系有可供參考的國際標準,對該體系的96孔板法進行了改進,在檢測酶活之前增加離心洗滌的操作,可以排除中藥顏色帶來的影響,改進后該方法可以高通量檢測中藥的體外致突變性,檢測結果與染色體畸變實驗結果較一致。
　　5.應用umu-lacZ體系對常用的幾十種中