中藥體外致突變性高通量檢測(cè)方法的探索.pdf

1、在細(xì)菌抗藥性成為全球性難題之際,中藥成為后抗生素時(shí)代解決細(xì)菌抗藥性的重要資源,不僅成為中國(guó)中長(zhǎng)期科技發(fā)展綱要中的主要內(nèi)容之一,也引起世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。因而,中藥的安全性也受到越來(lái)越多的關(guān)注。
　　鑒于中藥的使用方法目前仍然主要沿用中醫(yī)師藥方(多種中藥飲片的組合)—水煎液口服的服用模式,因此要關(guān)注中藥的安全性,首先要關(guān)注中藥飲片的安全性,其次才是復(fù)配過(guò)程的安全性。盡管中藥的使用具有悠久的歷史,但是目前國(guó)內(nèi)尚沒(méi)有完善的中藥飲片安全

2、性數(shù)據(jù)庫(kù),因而建立類(lèi)似的數(shù)據(jù)庫(kù)就顯得尤為重要。因此,本課題從如何修正和建立適合中藥飲片的體外致突變檢驗(yàn)的方法入手,利用微生物檢測(cè)的方法對(duì)中藥遺傳毒理學(xué)尤其是體外致突變性進(jìn)行初步的評(píng)價(jià),希望逐步建立常用中藥飲片和復(fù)方的體外致突變性數(shù)據(jù)庫(kù),為中藥的安全性提供參考數(shù)據(jù)。
　　藥品的安全性評(píng)價(jià)程序包括急性毒性檢測(cè)、遺傳毒性檢測(cè)(包括致突變性)、亞慢性毒性和慢性毒性檢測(cè)四個(gè)階段。之所以要對(duì)中藥的體外致突變性進(jìn)行檢測(cè),是因?yàn)轶w外致突變性檢測(cè)是

3、唯一能用微生物手段進(jìn)行檢測(cè)的指標(biāo),而且有大量的數(shù)據(jù)表明,待測(cè)物的致突變性和致癌性之間存在一定的相關(guān)性。因此,致突變性檢驗(yàn)成為國(guó)際上公認(rèn)的致畸和致癌檢驗(yàn)的初篩方法。針對(duì)中藥的特殊性質(zhì),做了如下工作:
　　1.體外致突變檢測(cè)的方法有很多,其中最經(jīng)典也是最為常用的是細(xì)菌回復(fù)突變實(shí)驗(yàn)(Ames試驗(yàn)),該方法在檢測(cè)中藥體外致突變過(guò)程中存在一些不足之處,比如檢測(cè)結(jié)果會(huì)受樣品中組氨酸成分的影響等。針對(duì)中藥的特殊性本實(shí)驗(yàn)室對(duì)Ames試驗(yàn)進(jìn)行了修正

4、,通過(guò)添加過(guò)量的組氨酸以掩蓋樣品中微量組氨酸帶來(lái)的影響,并用預(yù)培養(yǎng)的方法替代平板摻入法,簡(jiǎn)化了操作,修正后的Ames試驗(yàn)克服了中藥中組氨酸成分的影響。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用統(tǒng)一的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間且處理時(shí)間短(90min),事實(shí)上不同的待測(cè)物可能需要的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間不一樣,因此需要找到一個(gè)合適的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間,能夠使不同待測(cè)物的致突變性充分發(fā)揮出來(lái)。此外,Ames試驗(yàn)操作復(fù)雜,不適合對(duì)大量中藥進(jìn)行快速的評(píng)價(jià),因此本課題的主要內(nèi)容是尋找高通量的體外致突變檢測(cè)方法以

5、替代經(jīng)典Ames試驗(yàn)。之所以對(duì)Ames試驗(yàn)進(jìn)行修正,是因?yàn)樵摲椒ň哂锌蓞⒖嫉臉?biāo)準(zhǔn),能夠作為其他方法的一個(gè)參考。
　　2.從上世紀(jì)80年代開(kāi)始,經(jīng)典Ames試驗(yàn)的替代方法層出不窮,這其中應(yīng)用最多也是和Ames試驗(yàn)結(jié)果符合度最高的是基于SOS反應(yīng)的umu-lacZ體系。當(dāng)檢測(cè)菌株受到誘變劑作用后會(huì)啟動(dòng)SOS反應(yīng),umuDC基因表達(dá)上調(diào),通過(guò)檢測(cè)β-半乳糖苷酶的酶活就可以檢測(cè)樣品誘變性的強(qiáng)弱。目前,該方法被廣泛用于飲用水和污水的致突變檢

6、測(cè),并已制定了國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)。該方法需要檢測(cè)酶活,盡管可以高通量進(jìn)行,但是為了簡(jiǎn)化操作并排除中藥藥液的顏色對(duì)酶活檢測(cè)的影響,嘗試將報(bào)告基因lacZ替換為EGFP,構(gòu)建了umu-EGFP體系,經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,該體系檢測(cè)靈敏度太低,不適合中藥體外致突變檢測(cè);
　　3.為了提高檢測(cè)的靈敏度,將umuDC基因啟動(dòng)子替換為recA基因的啟動(dòng)子,構(gòu)建了rec-EGFP體系,經(jīng)過(guò)陽(yáng)性誘變劑的驗(yàn)證該體系可用于體外致突變檢測(cè)。通過(guò)與umu-lacZ體系以及之前

7、的染色體畸變結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),rec-EGFP體系在中藥的檢測(cè)中表現(xiàn)出了較高的陽(yáng)性率,但該體系在陽(yáng)性誘變劑的檢測(cè)中表現(xiàn)正常,其中的原因有待深入研究。
　　4.考慮到umu-lacZ體系有可供參考的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn),對(duì)該體系的96孔板法進(jìn)行了改進(jìn),在檢測(cè)酶活之前增加離心洗滌的操作,可以排除中藥顏色帶來(lái)的影響,改進(jìn)后該方法可以高通量檢測(cè)中藥的體外致突變性,檢測(cè)結(jié)果與染色體畸變實(shí)驗(yàn)結(jié)果較一致。
　　5.應(yīng)用umu-lacZ體系對(duì)常用的幾十種中