常見的檢疫性植物病毒高通量檢測方法的建立和比較.pdf

1、植物病毒廣泛存在于自然界,在寄主細(xì)胞內(nèi)寄生生活,專一性強(qiáng),影響植物的正常生長發(fā)育,造成農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)作物減產(chǎn)甚至導(dǎo)致某種植物滅亡從而影響生態(tài)系統(tǒng)。植物病毒種類繁多,本文中南芥菜花葉病毒(Arabis mosaci virus, ArMV),煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ringspot virus, TRSV)和番茄環(huán)斑病毒(Tomato ringspot virus,ToRSV)是線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)的代表,番茄斑萎

2、病毒屬(Tospovirus)是布尼亞病毒科(Bunyaviridae)中唯一侵染植物的病毒屬,代表種有番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)、鳳仙花壞死斑病毒(Impatiens necrotic spot virus, INSV)和鳶尾花黃斑病毒(Irisyellow spot virus,IYSV)。
　　目前進(jìn)境檢疫口岸常用的植物病毒檢測方法有血清學(xué)和分子生物學(xué),其中血清學(xué)用于植物病

3、毒的初篩,分子生物學(xué)由于檢測靈敏度較高,用于病毒的進(jìn)一步確定。然而,植物病毒在寄主體內(nèi)分布不均,含量低,檢測取樣的局限性等因素會(huì)影響檢測的靈敏度。本研究將保存的ArMV毒源添加到進(jìn)境的百合種球中作為實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)行免疫磁珠吸附和PEG沉淀兩種不同的前處理方法,將經(jīng)過兩種不同前處理和未經(jīng)任何前處理的實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明前處理可以大大富集分布不均的植物病毒,提高檢出率,在此實(shí)驗(yàn)中PEG沉淀富集的效果優(yōu)于免疫磁珠吸附。

4、r>　　近幾年,各口岸進(jìn)境農(nóng)作物不斷增加,傳統(tǒng)意義上的PCR檢測靈敏度較高,通量低。本研究以Agdia公司購買的ToRSV和TRSV毒源, ArMV侵染的百合種球?yàn)閷?shí)驗(yàn)材料,根據(jù)ArMV、ToRSV和TRSV的CP基因設(shè)計(jì)合成多對(duì)引物,進(jìn)行篩選,優(yōu)化反應(yīng)條件,進(jìn)行特異性和靈敏度驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行多重PCR,優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件,分別擴(kuò)增出ArMV438bp,TRSV300bp,ToRSV131bp的特異性片段,建立了同時(shí)檢測百合種球

5、中ArMV、TRSV和ToRSV的多重RT-PCR體系和SYBR-Green PCR體系,大大縮短了檢測時(shí)間,簡化了操作步驟,具有較強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值,適合進(jìn)境植物的快速檢測,在出入境檢驗(yàn)檢疫中具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　本研究還通過聚苯乙烯熒光微球與病毒多抗交聯(lián),采用標(biāo)記有生物素的另一配對(duì)單抗以及藻紅蛋白標(biāo)記的親和素組成相應(yīng)的熒光報(bào)告系統(tǒng),用液相芯片儀Luminex200檢測待檢樣本熒光強(qiáng)度,建立了TSWV、INSV及IYSV液相芯片高

6、通量檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明能同時(shí)檢測出這幾種病毒而不發(fā)生交叉反應(yīng)。將液相芯片與DAS-ELISA的檢測靈敏度進(jìn)行比較,結(jié)果表明液相芯片檢測TSWV,INSV和IYSV的靈敏度高于DAS-ELISA1-2個(gè)稀釋度。以IYSV血清為例,在2012年9月20日到2012年10月26日間進(jìn)行重復(fù)性檢測,共計(jì)5次,計(jì)算變異系數(shù),其值均小于20％,說明該方法重復(fù)性較高。本實(shí)驗(yàn)建立的同時(shí)檢測三種病毒的液相芯片方法為進(jìn)一步建立其他檢疫性病毒同步檢測提供