H-,2-O-,2-誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷中CR的調(diào)控效應(yīng)及SIRT1、SIRT3的表達(dá).pdf

1、目的：
　　 采用H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，探討熱量限制(caloricrestriction，CR)對(duì)PC12細(xì)胞的效應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)SIRT1和SIRT3的表達(dá)變化，希望為抗神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷提供新的作用靶點(diǎn)，從而為延緩自由基或ROS所致神經(jīng)元的損傷甚至預(yù)防和治療神經(jīng)元退行性疾病提供新的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.細(xì)胞分為4組：分別為高糖組(Control組)、CR組(低糖組)、過(guò)氧化

2、氫加CR組(H2O2+CR組)、過(guò)氧化氫組(H2O2組)。
　　 2.用含不同濃度H2O2的培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞，并利用四氮唑藍(lán)檢測(cè)法(MTT法)確定一個(gè)對(duì)于細(xì)胞損傷較小且效果最好的藥物濃度作為氧化應(yīng)激源。
　　 3.采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞的凋亡變化；
　　 4.免疫熒光染色方法檢測(cè)SIRT1、SIRT3的表達(dá)與定位；
　　 5.分別提取各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)RNA和蛋白質(zhì)，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR和Western

3、blot檢測(cè)，檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組間SIRT1、SIRT3及總Caspase3的表達(dá)變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷中CR的保護(hù)效應(yīng)
　　 60μmol H2O2作用下，H2O2組中的PC12細(xì)胞活力與正常對(duì)照組比較可維持在70％以上；而120μmol H2O2作用下細(xì)胞活力顯著降低。因此，我們采用60μmol濃度的H2O2作為氧化應(yīng)激源觀察CR的效應(yīng)。60、120μmol H2O2作

4、用下，CR+H2O2組細(xì)胞生存率顯著高于H2O2組，且組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從而表明CR具有抗H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的效應(yīng)。
　　 2.TUNEL凋亡染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡率
　　 我們采用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示60μmol H2O2作用6h后，其凋亡率顯著較CR+H2O2多，即細(xì)胞核中棕色顆粒樣物質(zhì)顯著增多。可見CR可有效的延緩氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。

5、
　　 3.免疫熒光檢測(cè)PC12細(xì)胞內(nèi)SIR1和SIRT3的表達(dá)
　　 檢測(cè)SIRT1的表達(dá)中，紅色顆粒樣物質(zhì)為SIRT1蛋白，可于細(xì)胞核和細(xì)胞漿中表達(dá)，且主要于細(xì)胞漿中表達(dá)。檢測(cè)SIRT3的表達(dá)中，紅色顆粒樣物質(zhì)為SIRT3蛋白，綠色顆粒狀物質(zhì)為線粒體標(biāo)記的抗體，紅色和綠色熒光可完全重疊變?yōu)辄S色顆粒狀物質(zhì)，可見SIRT3為一種線粒體蛋白。
　　 4.Western blot檢測(cè)SIRT1和SIRT3的表達(dá)

6、>　　 我們采用Western blot來(lái)定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SIRT1和SIRT3的表達(dá)變化。與Control組比較，CR組中SIRT1和SIRT3表達(dá)升高(p＜0.05)；H2O2組中SIRT1和SIRT3蛋白表達(dá)下降(p＜0.05)；與H2O2組比較，CR+H2O2中SIRT1和SIRT3表達(dá)上升(p＜0.05)。
　　 5.mRNA水平檢測(cè)SIRT1和SIRT3的表達(dá)
　　 我們采用RT-PCR檢測(cè)SIRT1和SIR

7、T3的mRNA表達(dá)水平。與蛋白表達(dá)水平類似，與Control組比較，CR組中SIRT1和SIRT3表達(dá)升高(p＜0.05)，H2O2組中SIRT1和SIRT3表達(dá)下降(p＜0.05)。與H2O2組比較，CR+H2O2組中SIRT1和SIRT3表達(dá)上升(p＜0.05)。
　　 6.Western blot檢測(cè)PC12細(xì)胞Caspase-3蛋白
　　 我們采用細(xì)胞內(nèi)總Caspase-3蛋白的表達(dá)變化來(lái)檢測(cè)氧化應(yīng)激損傷中凋亡的

8、變化情況。實(shí)驗(yàn)分三組：Control組，H2O2組，H2O2+CR組。在H2O2作用下，細(xì)胞內(nèi)總Caspase-3表達(dá)增高(p＜0.05)，而在H2O2+CR組中，Caspase-3表達(dá)較H2O2組顯著下降(p＜0.05)。在過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷中，細(xì)胞內(nèi)Caspase-3活性顯著增高，而CR可有效的減少Caspase-3的激活。
　　 結(jié)論：
　　 1、CR具有抗過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的效應(yīng)，同時(shí)也可有效的延