Hainanenins基因克隆，活性鑒定及誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制初探.pdf

1、腫瘤是全世界死亡率最高的重大惡性疾病之一，在治療過程中常常伴隨著腫瘤的多藥耐藥性MDR產(chǎn)生、降低機(jī)體免疫力，最終導(dǎo)致化療失敗。克服腫瘤MDR，提高藥物靶向性一直是腫瘤治療中的難點(diǎn)。近來，由生物基因組編碼的具有抵抗外源性微生物侵害、清除體內(nèi)病變細(xì)胞活性的抗癌肽ACPs，被發(fā)現(xiàn)具有廣譜殺菌、抑病毒、抑殺腫瘤細(xì)胞等作用。由于其抗腫瘤活性顯著，分子量小，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，理化性質(zhì)穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性，以及對(duì)哺乳動(dòng)物正常細(xì)胞毒性較低等特點(diǎn)，已經(jīng)成為抗腫瘤

2、藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。
　　本實(shí)驗(yàn)中，以海南湍蛙(Amolops hainanensis)為研究對(duì)象，從其背皮分泌物中直接分離得到2種活性多肽。隨后利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過構(gòu)建背皮組織cDNA文庫(kù)，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增序列，最終從31個(gè)連接產(chǎn)物中得到10種多肽序列，通過序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這10種多肽分屬于4個(gè)家族，其中有5條高度同源的序列屬于一個(gè)新的家族，并且其中一條與分泌物中純化得到的多肽序列相同。根據(jù)物種種屬名稱，我們將這個(gè)家族命名為haina

3、nenins并以序號(hào)1～5分別命名5條多肽，他們成熟肽部分都是由21個(gè)氨基酸殘基組成，C末端由15位和21位的半胱氨酸連接成含有7個(gè)氨基酸殘基的二硫環(huán)。
　　我們選取hainanenin-1和hainanenin-5檢測(cè)了抗菌活性、抗氧化性、溶血性抑制抗腫瘤活性，結(jié)果顯示:Hainanenin-1和hainanenin-5對(duì)17種細(xì)菌都有明顯的抗菌活性，抗氧化性不明顯，溶血性相對(duì)較高;其中Hainanenin-1對(duì)5中癌細(xì)胞都有明

4、顯的抑制生長(zhǎng)的活性，IC50值在10～13μM之間，對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的IC50值低至6.9μM。而對(duì)人臍靜脈細(xì)胞HUVEC，抑制生長(zhǎng)作用不明顯，在其他腫瘤細(xì)胞IC50濃度范圍內(nèi)，可以認(rèn)為對(duì)其生長(zhǎng)無影響。掃描電鏡結(jié)果顯示，經(jīng)hainanenin-1處理的MCF-7，細(xì)胞膜表面微絨毛斷裂，質(zhì)地由粗糙變得光滑，細(xì)胞形狀由貼壁的梭形變成圓形，并且細(xì)胞膜發(fā)泡形成囊狀結(jié)構(gòu)，并最終破裂，在膜上形成孔洞，破壞細(xì)胞膜的完整性;細(xì)胞早期凋亡時(shí)，細(xì)胞膜

5、上磷脂酰絲氨酸外翻，可與膜染料AnnexinⅤ-FITC結(jié)合，連同核酸染料PI進(jìn)行雙染，檢測(cè)藥物處理后細(xì)胞的早期凋亡率，結(jié)果顯示IC50濃度的hainanenin-1處理細(xì)胞24h后，MCF-7細(xì)胞早期凋亡率達(dá)到62％; Hoechst33258染色結(jié)果顯示，hainanenin-1能夠引起染色體凝集細(xì)胞核皺縮;最后，通過檢測(cè)caspase-1，3，9的活化率發(fā)現(xiàn)，hainanenin-1能夠大量激活MCF-7細(xì)胞內(nèi)caspase3和c