單側(cè)前牙反牙合導致顳下頜關節(jié)骨關節(jié)炎改變的動物模型構(gòu)建.pdf

1、顳下頜關節(jié)（temporomandibular joint,TMJ）是OA(osteoarthritis)發(fā)生的最常見部位之一，也是顳下頜關節(jié)紊亂病TMD的重癥表現(xiàn)形式之一。TMJ的功能運動和生物機械力與咬合的關系相當密切，而異常咬合被認為是TMJ OA的潛在病理因素。最近我課題組分別報道了在大鼠和小鼠上下前牙上安裝一種金屬不良修復體導致動物單側(cè)前牙反牙合（unilateral anterior crossbite,UAC），從而誘導出

2、TMJ OA的病損。本研究旨在前期工作基礎上進一步從從影像學（運用micro-CT）、大體觀察（用體視顯微鏡）、組織學研究（HE染色和番紅O/固綠染色）、超微結(jié)構(gòu)觀察（用透射電鏡）以及相關基因的mRNA水平變化（用real-time PCR）等方面對TMJ OA病損的發(fā)生和發(fā)展以及性別差異等多方面對我們單側(cè)前牙反牙合動物模型進行全面系統(tǒng)的評價。
　　第一部分大鼠單側(cè)前牙反牙合模型的建立和標本的收集、以及髁狀突表面的大體形態(tài)學觀察結(jié)

3、果
　　目的：建立單側(cè)前牙反牙合動物模型，用體視顯微鏡對髁狀突表面進行大體宏觀觀察。方法：由第四軍醫(yī)大學動物中心提供120只6周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠，分別為雌性60只（體重140-160g），雄性60只（150-170g）。所有對大鼠的飼養(yǎng)和操作規(guī)程均得到第四軍醫(yī)大學倫理委員會的許可，并嚴格遵循其規(guī)章制度執(zhí)行，按照一定的規(guī)格制作大鼠左側(cè)上下切牙金屬套筒冠，其中左下切牙的金屬套筒冠有一與其長軸呈135度唇向傾斜

4、的平面導板。這樣，實驗組（UAC組）大鼠左側(cè)切牙呈反向咬合，而右側(cè)切牙咬合正常。而對照組采用同樣的處理方法和飼養(yǎng)條件，但不粘結(jié)左上下切牙的金屬套筒冠，直至實驗結(jié)束。分別在UAC手術(shù)后4、12、20周后，對這三個時間點的大鼠TMJ進行取材，用來進行micro-CT掃描、大體觀察、組織化學染色、透射電鏡觀察以及相關基因的mRNA水平檢測等。大體觀察方法：將髁狀突頭從TMJ關節(jié)囊中脫出，剝離周圍軟組織，用冠剪從其髁狀突頸部剪下髁狀突頭，立即放

5、入0.9％生理鹽水中，編上編號，馬上在體視顯微鏡下進行觀察及拍照，并按照一定的評價標準對每個髁狀突進行評價。
　　結(jié)果：雌雄動物的對照組髁狀突軟骨表面大多呈光滑連續(xù)、豐滿的梭形。4周時，UAC組髁狀突表面變?yōu)槭蓍L的梭形；12周時，UAC組髁狀突表面出現(xiàn)輕微變形、中部出現(xiàn)明顯的淺凹陷；而到20周時，中部的凹陷更嚴重，致使髁狀突表面呈“葫蘆狀”或“8字形”的變形。
　　結(jié)論：UAC使大鼠髁狀突出現(xiàn)變形，并且這種變形隨著時間的推移

6、而加重。
　　第二部分 Micro-CT對髁狀突軟骨下骨進行影像學研究
　　目的：用來掃描、評估UAC導致大鼠髁軟骨下骨的長程變化。
　　方法：在髁狀突軟骨下骨的中部和后部選擇兩個圓柱體（長軸0.5mm，直徑0.25mm）作為感興趣區(qū)，在此感興趣區(qū)內(nèi)，用Mimics16.0對BV/TV（骨體積分數(shù)），BS/BV(骨表面積和骨體積之比)，Tb.Th(骨小梁厚度)、Tb.Sp（骨小梁間隙）、Tb.N（骨小梁數(shù)量）進行計算，

7、然后取兩者的平均值作為最終統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：雌雄動物4、12、20周UAC組的BV/TV值均低于其各自的同齡對照組。雌雄動物UAC組4周和12周的TB.SP值均高于各自的同齡對照組。雌性動物4周和12周的BS/BV值均高于各自的同齡對照組。而雄性動物只有4周時，其UAC組BS/BV高于其對照組。雌性動物12周和20周時，UAC組的Tb.Th值均高于各自的同齡對照組，而雄性動物只有在20周時，其UAC組Tb.Th高于其對照組。雄

8、性動物4周和12周UAC組的TB.N值均低于各自的同齡對照組。而雌性動物只有在4周時，其UAC組的TB.N數(shù)值低于其對照組。
　　結(jié)論：UAC導致三個時間點實驗組大鼠髁狀突軟骨下骨骨質(zhì)丟失，但這種骨質(zhì)丟失的幅度隨著時間的推移而逐漸減弱。
　　第三部分組織化學染色及組織學評分
　　目的：用組織化學染色對TMJ進行觀察和評分。
　　方法：常規(guī)HE染色和番紅O/固綠染色。
　　結(jié)果：雌雄動物在4、12和20周UA

9、C組其組織學評分均高于各自的同齡對照組，并且其評分隨著時間的推移而增加。而無論雌雄，其4周UAC和12周對照組相比、12周UAC組和20周對照組相比，組織學評分均無統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：UAC導致大鼠TMJ髁狀突評分增加，并且其增加趨勢隨著時間的延長而加重。UAC導致大鼠TMJ評分增加的趨勢類似于提前老化。
　　第四部分透射電鏡對髁狀突軟骨進行超微結(jié)構(gòu)觀察
　　目的：觀察UAC刺激導致髁狀突軟骨出現(xiàn)的超微結(jié)果變化。<

10、br>　　方法：用2.5%的戊二醛和1%的四氧化鋨固定髁狀突軟骨標本，10%EDTA脫鈣，用水漂洗后，梯度乙醇脫水、氧化丙烯處理、環(huán)氧樹脂812過夜。之后，在60℃烤箱中固化。用顯微鏡超薄切片機超薄切片處理，用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛對切片進行染色后用透射電鏡進行觀察。
　　結(jié)果：雌雄動物UAC組髁狀突軟骨中都出現(xiàn)了排列紊亂的膠原纖維和纖維間隙的擴大、軟骨細胞周圍鈣化痕跡的增多。另外，雌性UAC組髁狀突軟骨增殖層細胞質(zhì)中出現(xiàn)大量的自噬泡

11、，并且隨著時間的推移而逐漸增多。
　　結(jié)論：UAC導致雌雄大鼠髁狀突軟骨出現(xiàn)膠原纖維稀疏、排列紊亂、軟骨細胞周圍基質(zhì)鈣化增強、雌性動物中自噬泡的大量出現(xiàn)等，這些結(jié)果顯示雄性的超微結(jié)構(gòu)的變化沒有雌性明顯。
　　第五部分髁狀突軟骨的 mRNA水平檢測
　　目的：檢測相關基因在UAC所致髁狀突軟骨退變中的變化，初步探討TMJ OA的病理機制。
　　方法：用來自于兩只大鼠TMJ的髁狀突軟骨組織（n=2）進行RNA提取，反

12、轉(zhuǎn)后進行real-time PCR檢測和分析。這樣共進行三次，每次對來自兩只不同大鼠TMJ髁狀突軟骨組織（n=2）進行RNA提取、real-time PCR檢測。取三次檢測結(jié)果的均值作為最終統(tǒng)計數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：和各自的同時間點同齡對照相比，Aggrecan和Col2a1的mRNA水平在4、12和20周的雌雄UAC組中均呈下降趨勢。在雌性UAC組中，Adamts-4和
　　Adamts-5，在4周時與同時間點同齡對照相比升高

13、，而在12周和20周時與同時間點同齡對照相比降低。而在雄性UAC組，Adamts-4和Adamts-5在4周時比同時間同齡對照相比呈升高趨勢；而在12周時與同時間點同齡對照相比呈降低趨勢（p=0.003，p=0.002）；但在20周時，與同時間點同齡對照相比無統(tǒng)計學差異。Mmp3在雌雄動物4、12和20周，其UAC組的mRNA表達量均高于各自同時間點的同齡對照。Mmp13在4周雌雄UAC組與同時間同齡對照相比呈增高趨勢，在12周的雌雄U

14、AC組與同時間的同齡對照相比呈降低趨勢，在20周雌性UAC組與同時間點同齡對照相比呈降低趨勢，而在雄性動物中則呈與同時間點同齡對照相比沒有統(tǒng)計學差異。與各自的同時間同齡對照組相比，雌雄4周UAC組的Col10mRNA水平均呈增加趨勢，而在12周和20周UAC組中呈減少趨勢。Alp的mRNA表達水平在雌雄4周UAC組均高于各自的同時間點同齡對照組，而在12周和20周的UAC組中均低于各自同時間點的同齡對照組。與同時間點同齡對照相比，Run