TERT基因轉(zhuǎn)染骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞移植對(duì)5-6腎切除大鼠腎臟損傷的修復(fù)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建攜帶端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)基因的真核表達(dá)載體Zs Green1-C1-TERT重組質(zhì)粒，觀察轉(zhuǎn)染TERT基因后對(duì)SD大鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)生物學(xué)效應(yīng)的影響，研究EPCs和轉(zhuǎn)染TERT基因的EPCs移植對(duì)5/6腎切除模型大鼠的腎臟修復(fù)作用及其可能機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.構(gòu)建攜帶TERT基因的真核表達(dá)載體pZsGreen1-C1-

2、TERT質(zhì)粒:采用RT-PCR方法從幼鼠肝臟總RNA中擴(kuò)增出TERT片段，通過雙酶切方法將其與pZsGreen1-C1載體連接，得到pZsGreen1-C1-TERT重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶BglⅠ和EcoRⅠ酶切，進(jìn)行凝膠電泳鑒定和DNA序列分析。
　　 2.分離、培養(yǎng)EPCs:采用密度梯度離心法分離SD大鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞，EGM-2特異性培基誘導(dǎo)培養(yǎng)EPCs。通過細(xì)胞形態(tài)觀察、細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定、攝取DIL

3、-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-Ⅰ能力試驗(yàn)鑒定EPCs。
　　 3.轉(zhuǎn)染pZs Green1-C1-TER T質(zhì)粒至EPCs:采用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000將重組質(zhì)粒pZsGreen1-C1-TERT轉(zhuǎn)染至EPCs(pZsGreen1-C1-TERT-EPCs),并pZsGreen1-C1轉(zhuǎn)染至EPCs(pZsGreen1-C1-EPCs)設(shè)為空質(zhì)粒對(duì)照組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)早期凋亡

4、情況，Westem blot和Real-Time PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TERT mRNA和蛋白表達(dá)。
　　 4.檢測(cè)EPCs和轉(zhuǎn)染TERT基因的EPCs移植對(duì)5/6腎切除模型大鼠的腎臟保護(hù)作用及其機(jī)制:雌性6周齡SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham，24只）、5/6腎切除模型組（Model，24只）、EPCs移植組(EPCs-N，24只)、pZsGreen1-C1-EPCs移植組(pZ-EPCs-N，40只)、pZsGreen1-C1

5、-TERT-EPCs移植組（pZ-TERT-EPCs-N，40只）。各組于5/6腎切除術(shù)后一周分別尾靜脈注射PBS、PBS、EPCs、pZsGreen1-C1-EPCs和Zs Green1-C1-TERT-EPCs細(xì)胞懸液1ml。于注射后3d、1w、2w、3w、4w、6w、8w、12w各處死2只PZ-EPCs-N組和pZ-TERT-EPCs-N組大鼠，取新鮮腎臟、肝臟、脾臟、心臟及血涂片，在倒置熒光顯微鏡下觀察各組織綠色熒光蛋白Gree

6、nl的表達(dá)。同時(shí)于注射后4w、8w、12w收集尿液和血液用于檢測(cè)24h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮和內(nèi)生肌酐清除率，收集腎組織進(jìn)行腎臟組織病理分析，計(jì)算CD34陽性管周毛細(xì)血管密度，用Western blotting、Real-Time PCR方法檢測(cè)TERT、TGF-β1、角蛋白、波形蛋白、α-SMA、VEGF蛋白和基因表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.用RT-PCR方法從幼鼠肝臟總RNA中擴(kuò)增出的基因?yàn)?399bp，與所

7、需大小TERT cDNA一致。對(duì)重組質(zhì)粒pZs Green1-C1-TERT進(jìn)行酶切、凝膠電泳和DNA序列分析，結(jié)果顯示基因大小和基因序列與目的基因TERT一致。
　　 2.骨髓單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過EGM-2誘導(dǎo)后呈現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞表面同時(shí)表達(dá)CD133、vWF和VEGFR-2，能夠同時(shí)攝取DIL-ac-LDL和結(jié)合FITC-UEA-Ⅰ。
　　 3.重組質(zhì)粒pZsGreen1-C1-TERT和空質(zhì)粒pZsGreen1-C

8、1轉(zhuǎn)染內(nèi)皮祖細(xì)胞在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光，轉(zhuǎn)染率為70％。EPCs組和pZsGreen1-C1-EPCs組細(xì)胞在14d、21d和28d均有較低水平的TERTmRNA和蛋白表達(dá)，且28d時(shí)表達(dá)量較14d表達(dá)量均明顯降低(P均＜0.05)。培養(yǎng)第28d時(shí)，pZsGreen1-C1-TERT-EPCs組細(xì)胞增殖活性明顯高于EPCs組和pZsGreen1-C1-EPCs組細(xì)胞（P均＜0.05）、凋亡比例顯著低于EPCs組和pZsGreen1-

9、C1-EPCs組細(xì)胞（P均＜0.05）。
　　 4.(1)尾靜脈注射后，表達(dá)Greenl的移植細(xì)胞pZsGreen1-C1-EPCs和pZsGreen1-C1-TERT-EPCs逐漸定位于殘腎中。(2)在各時(shí)間點(diǎn)，Model組大鼠體重增長和肌酐清除率均明顯低于Sham組（P＜0.05），24h尿蛋白定量、血清尿素氮、肌酐水平均高于Sham組（P＜0.05）;EPCs-N組、pZ-EPCs-N組和pZ-TERT-EPCs-N組在第

10、8w和第12w血清尿素氮、肌酐水平較Model組降低(P＜0.05)，肌酐清除率較Model組升高(P＜0.05)，尤其以12w時(shí)pZ-TERT-EPCs-N組明顯(P＜0.05)。(3)與Sham組相比，Model組腎間質(zhì)病理評(píng)分明顯增高(P＜0.05)，腎間質(zhì)管周毛細(xì)血管密度降低(P＜0.05)，且隨時(shí)間延長病變逐步加重;細(xì)胞移植后三組大鼠腎臟病理損傷較Model組均降低（P＜0.05），管周毛細(xì)血管密度有不同程度增高;12w時(shí)pZ

11、-TERT-EPCs-N較EPCs-N組、pZ-EPCs-N組治療效果更明顯。(4)TERT mRNA和蛋白在Model組和Sham組腎組織中無表達(dá)，在EPCs-N組、pZ-EPCs-N組僅第4w有少量表達(dá)，在pZ-TERT-EPCs-N組4w、8w和12w均有表達(dá)，且均高于EPCs-N組、pZ-EPCs-N組第4w時(shí)表達(dá)量(P＜0.05)。(5) TGF-β1 mRNA和蛋白在Sham組僅低量表達(dá)，Model組4w、8w、12w表達(dá)逐

12、漸增高(P＜0.05);各移植組表達(dá)量較Model組均有降低(P＜0.05)，pZ-TERT-EPCs-N組降低最明顯（P＜0.05）。(6)與Sham組相比，Model組大鼠開始進(jìn)行性高表達(dá)波形蛋白和α-SMA，低表達(dá)角蛋白(P＜0.05);與Model組相比，EPCs-N組和pZ-EPCs-N組波形蛋白、α-SMA表達(dá)上調(diào)和角蛋白表達(dá)下調(diào)水平均有減弱(P＜0.05)，pZ-TERT-EPCs-N組在第12w時(shí)效果更顯著。(7) VE

13、GF表達(dá)在Model組表達(dá)量明顯低于Sham組，EPCs-N組、pZ-EPCs-N和pZ-TERT-EPCs-N組VEGF基因和蛋白水平表達(dá)較Model組均增高(P＜0.05)。(8)相關(guān)性分析顯示，管周毛細(xì)血管密度與24h尿蛋白定量、血清尿素氮、肌酐均呈顯著負(fù)相關(guān)，與肌酐清除率呈正相關(guān)，與腎間質(zhì)病理評(píng)分顯著負(fù)相關(guān)，與TGF-β1、波形蛋白和α-SMA的表達(dá)均呈顯著負(fù)相關(guān)，與角蛋白和VEGF表達(dá)呈顯著正相關(guān)。
　　 結(jié)論:

14、>　　 1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pZsGreen1-C1-TERT。
　　 2.成功將骨髓單個(gè)核細(xì)胞誘導(dǎo)分化為骨髓EPCs，并導(dǎo)入TERT基因重組質(zhì)粒，構(gòu)建了具有高表達(dá)TERT基因、高增殖活性的pZsGreen1-C1-TERT-EPCs。
　　 3.尾靜脈注射移植骨髓EPCs能夠顯著修復(fù)5/6腎切除大鼠模型的腎臟病理損傷，改善腎功能，其機(jī)制可能與上調(diào)VEGF表達(dá)和保護(hù)腎間質(zhì)微血管損傷、以及下調(diào)TGF-β1表達(dá)和阻遏腎小