重組1型腺相關病毒介導hHGF轉(zhuǎn)染ADMSCs治療大鼠急性心肌梗死的實驗研究.pdf

1、目的：觀察rAAV1-EGFP轉(zhuǎn)染對于脂肪源間充質(zhì)干細胞(ADMSCs)生物學特性的影響；檢測rAAV1-EGFP體外轉(zhuǎn)染ADMSCs后，ADMSCs-EGFP同種異體移植能否在梗死心肌局部持續(xù)表達外源性EGFP。研究rAAV1-1HGF體外轉(zhuǎn)染對于ADMSCs分泌功能的影響；探討同種異體ADMSCs-hHGF移植治療大鼠急性心肌梗死的可行性及有效性。 方法：(1)觀察rAAV1-EGFP轉(zhuǎn)染對于ADMSCs生物學特性的影響。取

2、雄性Wister大鼠附睪處脂肪組織，消化分離法獲取ADMSCs，體外培養(yǎng)、擴增及鑒定，rAAV1-EGPF轉(zhuǎn)染，觀察轉(zhuǎn)染后ADMSCs生長特點、表面特異性標記、多向分化潛能的變化情況。(2)鑒定同種異體ADMSCs-EGFP移植能否在急性心肌梗死大鼠的心肌局部持續(xù)表達外源性EGFP。將60只雄性Wister大鼠隨機平均分為陰性對照組(n=15)、細胞移植1周組(n=15)、細胞移植4周組(n=15)、細胞移植8周組(n=15)，采用結扎

3、冠狀動脈左前降支的方法制備急性心肌梗死模型，采用經(jīng)心外膜心肌直接注射的方法，于心肌梗死區(qū)及其周圍分別注射PBS(陰性對照組)和ADMSCs-EGFP(細胞移植組)，分別于術后1周末、4周末及8周末處死細胞移植組大鼠，應用熒光顯微鏡、EGFP免疫組織化學染色和圖象分析方法檢測同種異體ADMSCs-EGFP移植能否在急性心肌梗死大鼠的心肌局部持續(xù)性表達外源性EGFP。術后8周末處死PBS組大鼠作為陰性對照。(3)構建rAAV1-hHGF。A

4、DMSCs接種至6孔板，接種細胞隨機分為未轉(zhuǎn)染組(陰性對照組)和rAAV1-hHGF轉(zhuǎn)染組，應用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)測定轉(zhuǎn)染hHGF后第1～8天內(nèi)每日細胞上清液中hHGF濃度的變化情況，同時進行細胞計數(shù)，觀察細胞分泌能力的改變。(4)同種異體ADMSCs移植聯(lián)合轉(zhuǎn)基因hHGF治療大鼠急性心肌梗死。將100只雄性Wister大鼠隨機平均分為PBS組(n=25)，單純ADMSCs治療組(n=25)，單純hHGF治療組(n=25)，

5、ADMSCs-hHGF治療組(n=25)，采用結扎冠狀動脈左前降支的方法制備急性心肌梗死模型，經(jīng)心外膜心肌直接注射的方法給予相應治療。術后8周末采用導管法及超聲心動檢測判定心臟功能，隨后處死實驗動物，行形態(tài)學檢測并計算梗死面積(IS)、左室球形指數(shù)(S1)和擴張指數(shù)(DI)，天狼猩紅染色測定梗死區(qū)及非梗死區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原容積分數(shù)(CVF)，免疫組織化學染色檢測局部血管密度及MMP-2和MMP-9表達，行組織勻漿，應用RT-PCR法測定梗死

6、組織中hHGF的mRNA水平，應用Western blotting法測定梗死組織中hHGF蛋白表達情況。 結果：(1)rAAv1-EGFP轉(zhuǎn)染后，大鼠ADMSCs可正常貼壁，生長迅速，細胞倍增時間(DT)約52.5h，多次傳代后形態(tài)上無明顯改變，其細胞表面特異性標記及多向分化潛能未受明顯影響。(2)同種異體轉(zhuǎn)基因ADMSCs-EGFP移植后，1周及4周時于梗死心臟局部均可觀察到綠色熒光及相應部位EGFP的表達，兩者相比無顯著差異

7、，移植后8周時梗死局部綠色熒光明顯減弱，但仍可見少量EGFP表達。對照組未觀察到綠色熒光及相應部位EGFP的表達。(3)成功構建攜帶目的基因hHGF的rAAV1。與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)基因ADMSCs-hHGF組上清液中hHGF的濃度及細胞分泌hHGF的能力均顯著增加。(4)心肌梗死8周后，與PBS組相比，單純ADMSCs組和轉(zhuǎn)基因ADMSCs-hHGF組射血分數(shù)(EF)、左室搏出量(LVSV)及左室舒張末容積(LVEDV)顯著增加，+dt

8、/dpmax、+dt/dpmax/LVSP以及-dt/dpmax、-dt/dpmax/LVSP顯著升高，左室相對重量顯著增加，梗死區(qū)及邊緣區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原容積分數(shù)均顯著降低，而局部血管數(shù)目顯著增多，MMP-2、MMP-9顯著減少，但細胞凋亡指數(shù)(AI)沒有明顯變化。與單純ADMSCs組相比，轉(zhuǎn)基因ADMSCs-hHGF組局部血管數(shù)目增加更為明顯，而MMP-9減少程度低于前者。同時，在細胞移植8周后，單純hHGF組和轉(zhuǎn)基因ADMSCs-hH