狨猴肝細(xì)胞系的建立和功能研究.pdf

1、目的：
　　肝臟是調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)多種生理反應(yīng)，例如糖原貯存、脂肪代謝、蛋白分泌和藥物代謝等的重要器官。而肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞作為肝臟最主要的細(xì)胞類(lèi)型，對(duì)于維持肝臟代謝、解毒和穩(wěn)態(tài)等功能起著不可或缺的作用。因此，肝細(xì)胞是研究肝臟代謝、肝疾病發(fā)病機(jī)制、肝移植和藥物篩選等重要的細(xì)胞模型。隨著嚙齒類(lèi)動(dòng)物肝細(xì)胞系的建立和應(yīng)用，篩選出很多新型的肝病治療藥物，但是因?yàn)檫z傳背景的差異，藥物治療在實(shí)際應(yīng)用中達(dá)不到預(yù)期效果。因此更能代表人類(lèi)遺傳背景的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物越來(lái)

2、越多地被應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)研究。普通狨猴（ common marmoset），作為新大陸猴，因?yàn)轶w型小、繁殖率高、生理特性與人類(lèi)類(lèi)似等特點(diǎn)，已經(jīng)被成功應(yīng)用于帕金森綜合癥等神經(jīng)退化性疾病模型。另外，狨猴對(duì)肝臟疾病比較敏感，已經(jīng)被成功地用做GBVB-HCV嵌合病毒猴模型，但是目前還沒(méi)有可以成功感染嵌合病毒的肝細(xì)胞模型，因此狨猴肝細(xì)胞系的建立對(duì)于肝病及其他疾病的研究和臨床轉(zhuǎn)化意義重大。本研究致力于建立具有增殖能力和代謝及體內(nèi)再生能力的狨猴肝

3、細(xì)胞系，以期為人類(lèi)肝臟疾病的發(fā)病機(jī)理，藥物篩選及治療等提供良好的靈長(zhǎng)類(lèi)肝細(xì)胞模型。
　　方法：
　　1.狨猴原代肝細(xì)胞的分離與傳代培養(yǎng)：利用膠原酶IV消化2周大流產(chǎn)狨猴肝組織，離心，鋪于6孔板。利用威廉姆斯E培養(yǎng)基，同時(shí)添加20ng/ml肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、20ng/ml表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、1×胰島素鐵硒傳遞蛋白、10％10099血清、10μM地塞米松、10%青/鏈霉素、10%L-谷氨酰胺、75mg牛血清白蛋白、10ng/ml煙酰

4、胺。
　　2.狨猴肝細(xì)胞系建系方法的優(yōu)化：利用慢病毒包裝體系psPAX2和pMD2.G分別包裝猴病毒大 T抗原和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)粒，并且轉(zhuǎn)染原代狨猴肝細(xì)胞。通過(guò)綠色熒光蛋白和嘌呤霉素抗性篩選，以獲得成功感染的陽(yáng)性細(xì)胞克隆。
　　3.狨猴肝細(xì)胞系的建立和驗(yàn)證：通過(guò)檢測(cè)猴病毒大T抗原轉(zhuǎn)染的原代肝細(xì)胞，連續(xù)的傳代次數(shù)、增殖能力和形態(tài)學(xué)，以證明狨猴肝細(xì)胞系的建立。
　　4.狨猴肝細(xì)胞系染色體穩(wěn)定性及成瘤性檢測(cè)：通過(guò)細(xì)胞核型的

5、提取、DAPI染色、染色體數(shù)目的統(tǒng)計(jì)和分型，以證明狨猴肝細(xì)胞系在建系過(guò)程中是否存在染色體的丟失與重組；通過(guò)裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)，以證明狨猴肝細(xì)胞系是否在建系過(guò)程中發(fā)生癌化。
　　5.狨猴肝細(xì)胞系相關(guān)基因表達(dá)譜分析：通過(guò)半定量RT-PCR和共聚焦顯微鏡檢測(cè)，分別從基因和蛋白水平的表達(dá)，以驗(yàn)證狨猴肝細(xì)胞系在肝臟特異基因的表達(dá)情況。
　　6.狨猴肝細(xì)胞系超微結(jié)構(gòu)分析和基本生理功能的驗(yàn)證：通過(guò)電鏡對(duì)狨猴肝細(xì)胞系的超微結(jié)構(gòu)，包括線粒體、肝

6、糖原和微絨毛等進(jìn)行觀察分析；通過(guò)糖原貯存、脂滴形成和吲哚菁綠（ICG）代謝試驗(yàn)，以證明狨猴肝細(xì)胞的體外代謝能力。
　　7.狨猴肝細(xì)胞系的藥物一級(jí)代謝和排出功能測(cè)試：通過(guò)半定量RT-PCR，對(duì)肝細(xì)胞一級(jí)代謝相關(guān)基因CYP家族中CYP3A4、CYP1A1、CYP1A2等，進(jìn)行基底水平表達(dá)分析和藥物（利福平、3-甲基膽蒽）刺激后相應(yīng)基因的表達(dá)定量分析，以驗(yàn)證狨猴肝細(xì)胞系藥物一級(jí)代謝能力；通過(guò)綠色熒光標(biāo)記CDFDA的攝入定位試驗(yàn)，以證明狨

7、猴肝細(xì)胞系是否具有膽管排出能力。
　　8.狨猴肝細(xì)胞系在FAH缺陷小鼠上的功能驗(yàn)證：延胡索酰乙酰乙酸水解酶缺陷型小鼠模型(FAH-/-)是一種肝臟代謝疾病小鼠模型，將1x107狨猴肝細(xì)胞，通過(guò)脾臟移植到FAH-/-小鼠肝臟中。利用FAH和GFP免疫組化染色，以檢測(cè)細(xì)胞移植后小鼠肝功能改善、體重和生存期變化等，與未移植細(xì)胞組小鼠比較，以證明狨猴肝細(xì)胞系在體內(nèi)的修復(fù)再生能力。
　　9.狨猴肝細(xì)胞系干性相關(guān)特性的研究：通過(guò)檢測(cè)肝干

8、細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)和3D培養(yǎng)誘導(dǎo)膽管分化試驗(yàn)，以證明狨猴肝細(xì)胞系是否具有肝干細(xì)胞的特性。
　　10.狨猴肝細(xì)胞其他方面研究：利用CRISPR-Cas9技術(shù)，敲除狨猴原代肝細(xì)胞中抑癌基因TP53，以確定其對(duì)狨猴肝細(xì)胞增殖能力和成瘤性的影響。通過(guò)裸鼠成瘤試驗(yàn)，以證明TP53基因敲除對(duì)狨猴肝細(xì)胞癌化的影響。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離和獲取具有肝細(xì)胞上皮形態(tài)和增殖能力有限的狨猴原代肝細(xì)胞。
　　2.建系方法優(yōu)化試驗(yàn)，

9、確定猴病毒大T抗原慢病毒過(guò)表達(dá)的方法，建立狨猴肝細(xì)胞系效果更佳。
　　3.通過(guò)篩選獲取6個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞克隆，其中MHCL-1和MHCL-2細(xì)胞克隆可以穩(wěn)定傳代，并且連續(xù)培養(yǎng)超過(guò)100代以上，確認(rèn)其無(wú)限增殖能力。同時(shí)，共聚焦顯微鏡分析，發(fā)現(xiàn)：E-cadherin表達(dá)降低和 a-SMA表達(dá)升高，說(shuō)明肝細(xì)胞系有上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT）發(fā)生，但在傳代過(guò)程中形態(tài)無(wú)明顯變化。
　　4.狨猴肝細(xì)胞系染色體染色結(jié)果顯示：肝細(xì)胞系為正常狨猴染

10、色體條數(shù)46條，未發(fā)現(xiàn)染色體缺失、重組；通過(guò)吉姆薩G帶染色，將46條染色體分為23對(duì)；而裸鼠成瘤性試驗(yàn)結(jié)果表明：所獲得狨猴肝細(xì)胞系不具有成瘤性。
　　5.通過(guò)半定量RT-PCR和共聚焦顯微鏡檢測(cè)，對(duì)狨猴肝細(xì)胞系基因表達(dá)譜分析結(jié)果顯示：兩個(gè)狨猴肝細(xì)胞克隆，都表達(dá)大部分肝特異性基因，包括 ALB、AAT和HNF4A等，但是上皮細(xì)胞特異性基因表達(dá)減弱，包括CK19、CK7和CK18，證明狨猴肝細(xì)胞系雖然形態(tài)發(fā)生變化，但其肝細(xì)胞功能相關(guān)基

11、因表達(dá)基本正常。
　　6.通過(guò)吲哚菁綠（ICG）的攝入和排出、肝糖原染色和油紅染色等體外功能試驗(yàn)，證明狨猴肝細(xì)胞系具有肝細(xì)胞基本特性和生理功能。
　　7.通過(guò)檢測(cè)利福平和3-甲基膽蔥誘導(dǎo)前后，狨猴肝細(xì)胞系藥物一級(jí)代謝相關(guān)CYP家族中CYP3A4、1A1和1A2基因的表達(dá)水平，證明狨猴肝細(xì)胞系表達(dá)本底水平CYP，并且在藥物刺激下CYP表達(dá)增加。這些結(jié)果表明該狨猴肝細(xì)胞系具有藥物一級(jí)代謝相關(guān)活性。
　　8.通過(guò) FAH-/

12、-小鼠體內(nèi)移植狨猴肝細(xì)胞系試驗(yàn)，結(jié)果表明：與對(duì)照組相比，狨猴肝細(xì)胞系可以顯著改善5只移植小鼠肝功能、延長(zhǎng)其生存期和恢復(fù)其體重。FAH和GFP的免疫組化染色，也證明了狨猴肝細(xì)胞系具有體內(nèi)整合和再生能力。
　　9.在狨猴肝細(xì)胞干性試驗(yàn)中，通過(guò)半定量RT-PCR和共聚焦試驗(yàn)，證明狨猴肝細(xì)胞系表達(dá)肝干細(xì)胞相關(guān)基因，包括AFP和SOX9。同時(shí)，利用Matrigel和Collagen為基質(zhì)的3D培養(yǎng)，結(jié)果顯示：狨猴肝細(xì)胞系可以在體外分化為類(lèi)似

13、膽管的結(jié)構(gòu)，提示狨猴肝細(xì)胞系具有肝干細(xì)胞的特性。
　　10.在利用 Crispr-Cas9在原代肝細(xì)胞敲除試驗(yàn)中，通過(guò)基因組測(cè)序和 Western，證明獲得TP53-KO狨猴原代肝細(xì)胞模型；在裸鼠皮下成瘤試驗(yàn)中，通過(guò)病理染色確認(rèn)類(lèi)似畸胎瘤的出現(xiàn)，提示TP53的敲除可能會(huì)影響狨猴原代肝細(xì)胞的分化能力。
　　結(jié)論：
　　1、獲得了可穩(wěn)定傳代、表達(dá)肝特異性基因和染色體正常的狨猴肝細(xì)胞系MHCL-1和MHCL-2，且這些肝細(xì)胞