可回復永生化人胎肝細胞系的建立及其移植預防小鼠急性肝衰竭.pdf

1、背景和目的：
　　 急慢性肝衰竭是病毒性肝炎等各種病因導致的終末期肝病。目前雖然原位肝移植仍是治愈終末期肝衰竭的惟一方法，但肝移植費用很高，技術復雜，最關鍵的是受到供肝不足的限制。生物人工肝和肝細胞移植療法可暫時輔助或部分代替嚴重病變的肝臟功能，清除體內各種有害物質，代償肝臟相應的功能，從而使肝細胞得以再生直至自體肝臟功能恢復或等待機會進行肝移植，已成為替代肝移植和等待肝移植過渡治療的極具吸引力的選擇。但是，生物人工肝和肝細胞移

2、植的臨床應用同樣受到肝細胞來源缺乏的限制。因為用于生物人工肝及肝細胞移植的理想肝細胞應具有以下特征：①人源性；②表型正常；③易于獲得；④易于培養(yǎng)且能迅速生長至高密度；⑤具有良好的分化狀態(tài)及成熟肝細胞的全部生物代謝功能。理論上，人原代肝細胞是最理想的細胞材料，但由于成人供肝來源極其有限且僅用于肝移植，加之成人肝細胞在體外增殖能力差，故大量獲得成人肝細胞是不可能的。胎肝的利用因涉及倫理問題且同樣來源受限，亦無法滿足臨床需要。使用動物肝細胞又

3、存在發(fā)生免疫反應及傳播動物病毒的危險。因此上述兩種治療方法在很大程度上依賴于人肝細胞系的發(fā)展。原代肝細胞在體外培養(yǎng)不但難以增殖傳代，而且在一兩周內迅速失去原有的肝細胞代謝功能。通過基因轉移技術將猿猴病毒40大T抗原(simian virus40 large T antigen，SV40T)等具有永生化作用的基因轉到細胞中并穩(wěn)定表達，可使細胞獲得永生化同時保留一定的原代細胞特性。目前肝細胞永生化成為解決肝細胞來源的重要途徑之一。本研究目的

4、是應用攜帶SV40T基因的逆轉錄病毒表達載體pLNCTIGlox轉導原代人胎肝細胞，建立永生化人胎肝細胞系，并對該細胞系的功能特性，永生化細胞的可回復性以及脾內移植預防90％肝切除小鼠肝衰竭的效果進行研究。
　　 方法：
　　 1.用含新霉素耐藥基因(NeoR)、SV40T和增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因的逆轉錄病毒表達載體pLNCTIGlox轉染包裝細胞PT67，獲取病毒上清。用NIH3T3細胞滴定病毒滴度，免疫細

5、胞化學染色檢測上清感染的NIH3T3細胞中SV40T表達功能。
　　 2.體外兩步灌流法分離孕20周齡人胎肝細胞，常規(guī)單層培養(yǎng)原代人胎肝細胞。
　　 3.用逆轉錄病毒表達載體pLNCTIGlox病毒上清感染原代培養(yǎng)的人胎肝細胞，用G418選擇性培養(yǎng)，篩選成功轉導的永生化細胞系。
　　 4.免疫細胞化學染色檢測肝細胞特征蛋白的表達和SV40T蛋白的表達；糖原染色實驗檢測肝糖原合成情況；細胞計數(shù)法測定永生化細胞的增殖

6、特性，繪制生長曲線。
　　 5.用放射免疫法和自動生化分析儀分別檢測永生化細胞的白蛋白和尿素合成。
　　 6.用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)分析永生化細胞的肝細胞功能相關基因mRNA的表達。
　　 7.將4×106永生化細胞移植到嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠左腋下皮下，相同胎肝細胞移植到對側作為對照，長期觀察其是否形成腫瘤。
　　 8.采用90％肝切除術制備急性肝衰竭小鼠模型，小鼠分為4組：G1

7、組經脾移植106永生化細胞，G2組移植106原代胎肝細胞，G3組移植106 HepG2細胞，G4組注射0.1ml DMEM。通過檢測血氨和觀察細胞移植后小鼠存活情況，評價永生化細胞移植對急性肝衰竭的治療作用。
　　 9.用含Cre重組酶的逆轉錄病毒載體 pQCXIP-NLS-iCre-ERT2轉染包裝細胞Phoenix A，產生病毒上清轉導永生化細胞，建立含Cre-ERT2基因的可回復細胞系。
　　 10.用4-羥基-他

8、莫昔芬(OHT)誘導Cre-ERT2重組酶活性，切除SV40T基因，免疫細胞化學染色和PCR法檢測含Cre-ER基因的可回復永生化細胞受OHT誘導回復前后SV40T基因的表達和在基因組的整合情況。
　　 結果：
　　 1.逆轉錄病毒載體pLNCTIGlox轉染PT67細胞的病毒上清測得滴度為3×104CFU/ml。病毒上清感染的NIH3T3細胞經免疫細胞化學染色顯示SV40T陽性，表明pLNCTIGlox逆轉錄病毒載體可

9、成功轉導和表達SV40T基因。
　　 2.體外兩步灌流法分離孕20周齡人胎肝細胞，臺盼藍排斥法檢測細胞活力約95％，分離出的肝細胞總數(shù)高達109個。
　　 3.逆轉錄病毒上清感染人原代胎肝細胞后用500μg/ml的G418篩選，連續(xù)選擇培養(yǎng)14天獲得5個具有G418抗性的具有上皮表型的細胞集落，經擴大培養(yǎng)后表型最接近原代肝細胞的1個細胞系命名為HepCL。
　　 4.免疫細胞化學染色檢測HepCL肝細胞特征蛋白的

10、表達，結果A1b、CK18、CK19和SV40T均為陽性，前三者胞漿著色，后者定位于胞核。糖原染色結果弱陽性。從細胞生長曲線計算出細胞系培養(yǎng)第十代的群體倍增時間約為0.7天。
　　 5.用特異性人白蛋白放射免疫試劑檢測HepCL細胞培養(yǎng)上清中人白蛋白含量，生化儀檢測其尿素氮含量，計算出HepCL細胞系平均白蛋白和尿素合成量分別為3.6pg/cell/d和0.22pmol/cell/d。
　　 6.永生化細胞系HepCL成

11、瘤試驗：連續(xù)觀察16個月之久，在試驗和對照側移植處未見任何腫瘤形成。
　　 7.RT-PCR結果顯示HepCL細胞表達肝實質細胞特異的白蛋白、細胞角蛋白CK8、CK18、肝細胞生長因子(HGF)受體、α-1-抗胰蛋白酶(AAT)、細胞色素P4501B1(CYP450181)和膽管上皮細胞特異的CK7、CK19、膽汁糖蛋白、γ-谷氨酰轉肽酶。POU結構域轉錄因子八聚體結合蛋白4(Oct-4)和細胞周期調節(jié)因子p21也有表達。不表達

12、轉化生長因子受體Ⅱ型(TGF-βRⅡ)和Rex-1。
　　 8.急性肝衰竭SCID小鼠細胞移植結果顯示：G1組(移植HepCL)和G2組(移植胎肝細胞)較G3組(移植HepG2細胞)和G4組(注射DMEM)受體小鼠的生存率大大提高；血氨水平顯著降低；細胞移植兩周后，在移植HepCL細胞和原代人胎肝細胞的小鼠肝內可觀察到人白蛋白特異性染色陽性的肝細胞群。
　　 9.逆轉錄病毒載體pQCXIP-NLS-iCre-ERT2質粒

13、DNA轉染包裝細胞Phoenix A，嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定產病毒上清的細胞系，用HepG2細胞測得其病毒滴度為5x104CFU/ml。
　　 10.逆轉錄病毒載體pQCXIP-NLS-iCre-ERT2轉導HepCL細胞獲得穩(wěn)定整合Cre-ER?；虻腃re.HepCL細胞系。
　　 11.OHT誘導Cre-HepCL細胞系后，用免疫細胞化學染色法檢測SV40T抗原，結果回復后細胞中仍有少數(shù)細胞有表達，Cre-HepCL

14、細胞基因組仍可用PCR檢測到SV40T基因存在，Cre-HepCL細胞未能100％回復。
　　 結論：
　　 1.通過逆轉錄病毒載體pLNCTIGlox轉導原代人胎肝細胞并使之表達SV40T基因，成功建立了具有肝細胞表型的永生化人胎肝細胞系HepCL。
　　 2.實驗顯示HepCL兼具肝實質細胞和膽管上皮細胞的表達特征，表達白蛋白、細胞角蛋白CK8、18、7、19，HGF受體、AAT、CYP4501B1、GGT和