殼聚糖抑制家兔動靜脈內(nèi)瘺內(nèi)膜增生的實驗研究.pdf

1、目的:
　　本研究觀察殼聚糖對家兔頸總動脈-頸內(nèi)靜脈內(nèi)瘺術(shù)后血管內(nèi)膜增生的影響及TLR4/NF-κB通路在殼聚糖干預(yù)家兔動靜脈內(nèi)瘺(AVF)中發(fā)揮的作用。
　　方法:
　　體內(nèi)實驗部分:將21只新西蘭大耳白兔隨機分為3組:正常對照組(n=3)、模型組(n=9)及殼聚糖組(n=9)。模型組和殼聚糖組分別建立家兔頸總動脈-頸內(nèi)靜脈內(nèi)瘺模型,殼聚糖組AVF術(shù)后于AVF靜脈端血管及吻合口處涂抹殼聚糖,分別術(shù)后4周、6周及8周時

2、處死,取AVF靜脈端血管組織,分別標記為A組(正常對照組)、B組(4周模型組)、C組(4周殼聚糖組)、D組(6周模型組)、E組(6周殼聚糖組)、F組(8周模型組)、G組(8周殼聚糖組)。觀察各組家兔 AVF靜脈端血管組織的病理改變;應(yīng)用免疫組化方法檢測各組組織a-SMA的變化;RT-PCR方法檢測其組織的PCNA和TLR4 mRNA的表達;Western blot方法檢測其組織PCNA、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表達。各組實

3、驗數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　體外實驗部分:取成熟AVF的靜脈端血管采用組織貼壁法培養(yǎng)血管平滑肌細胞(VSMCs),成功培養(yǎng)的家兔VSMCs用于實驗。觀察不同濃度胎牛血清(FBS)對家兔VSMCs的PCNA、TLR4蛋白和mRNA表達水平的變化。選取TLR4表達量最高的胎牛血清濃度(20％FBS),用不同濃度殼聚糖(0、10、100、500、1000、2000 ug/ml)干預(yù)48h。采用RT-PCR方法檢測不同濃

4、度殼聚糖處理的細胞TLR4和PCNA的mRNA表達;Western blot法檢測各組細胞PCNA、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表達;細胞免疫熒光法檢測各組細胞TLR4和NF/κB表達和定位。選取殼聚糖處理后TLR4表達明顯改變的殼聚糖濃度(1000ug/ml),給予不同培養(yǎng)時間(0、12、24、48h)進行干預(yù)。采用RT-PCR方法檢測不同培養(yǎng)時間的細胞 TLR4和 PCNA的 mRNA表達;Western blot法檢測各

5、組細胞PCNA、TLR4、MyD88和NF-κB蛋白的表達;各組實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、家兔AVF術(shù)后4周靜脈端血管內(nèi)膜增厚,在血管內(nèi)膜增生中a-SMA染色陽性,VSMCs增殖明顯。隨著時間增加,內(nèi)膜增生更加明顯,管腔顯著狹窄, a-SMA表達顯著增高。與模型組相比,殼聚糖組內(nèi)膜增生程度明顯減輕,a-SMA水平明顯下降,VSMCs增殖亦顯著下降。
　　2、與正常對照組家兔比較,模

6、型組PCNA、TLR4、MyD88和NF-κB表達量隨著時間延長而增加,而殼聚糖組雖高于正常對照組,但是明顯低于模型組。
　　3、體外高濃度胎牛血清可以誘導(dǎo)VSMCs的TLR4表達,高濃度胎牛血清培養(yǎng)VSMCs的TLR4表達在一定范圍內(nèi)存在濃度依賴性。殼聚糖可抑制高濃度胎牛血清誘導(dǎo)的VSMCs中PCNA、TLR4、MyD88和NF-κB表達下調(diào),并呈濃度和時間依賴性。
　　結(jié)論:
　　1、殼聚糖能夠抑制家兔VSMCs增