抑制糖酵解途徑對(duì)胰腺癌細(xì)胞PANC-1生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為四部分：
　　 第一部分：胰腺癌組織、癌旁組織及胰腺正常組織乳酸脫氫酶活性及同工酶譜、琥珀酸脫氫酶活性表達(dá)變化
　　 目的：檢測(cè)胰腺正常組織、癌組織及癌旁組織中糖酵解關(guān)鍵酶-乳酸脫氫酶（lacatedehydrogenase，LDH）活性及其同工酶譜變化，以及琥珀酸脫氫酶（succinatedehydrogenase，SDH）活性的表達(dá)變化，分析糖酵解與胰腺癌生物學(xué)特性的關(guān)系。
　　 方法：收集我院自2

2、006年10月至2008年7月期間我院收治的12例胰腺導(dǎo)管腺癌患者手術(shù)切除標(biāo)本和12例胰島素瘤等良性病變及其正常胰腺組織。LDH活性檢測(cè)采用LDH檢測(cè)試劑盒；LDH 同工酶譜檢測(cè)采用法國(guó)Sebia公司的hydrasys 全自動(dòng)分析儀；酶組織化學(xué)染色檢測(cè)癌組織、癌旁組織及胰腺正常組織中琥珀酸脫氫酶活性的變化。
　　 結(jié)果：與正常胰腺組織相比，癌組織及癌旁組織中LDH活性明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；癌組織及癌旁組織中

3、LDH 同工酶譜分析顯示LDH4、LDH5 明顯升高，與正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。酶組織化學(xué)染色顯示，癌組織中琥珀酸脫氫酶表達(dá)活性較癌旁組織及正常組織活性明顯降低。
　　 結(jié)論：胰腺癌有氧氧化功能降低，糖酵解水平增強(qiáng)，其中LDH活性及其同工酶譜的變化可能和胰腺癌的發(fā)病機(jī)理相關(guān)，特異性抑制LDH可能成為胰腺癌新的治療策略。
　　 第二部分：體外乳酸脫氫酶特異性抑制劑-草氨酸鹽(oxamate)對(duì)胰腺癌

4、細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制及誘導(dǎo)凋亡作用
　　 目的：分析乳酸脫氫酶抑制劑-草氨酸鹽(oxamate)對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株增殖的影響及誘導(dǎo)凋亡的作用。
　　 方法：MTT法觀察終濃度為0mol/L，0.02mol/L，0.04mol/L，0.08mol/L，0.1mol/L草氨酸鹽分別作用于不含血清培養(yǎng)基及含10%血清培養(yǎng)基胰腺癌PANC-1細(xì)胞株24h、48h后，檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，同時(shí)行Hochest33342 及PI 染色

5、、流式細(xì)胞儀檢測(cè)草氨酸鹽對(duì)其凋亡的影響。
　　 結(jié)果：草氨酸鹽對(duì)人胰腺癌PANC-1細(xì)胞株的增殖有顯著的抑制作用，并且隨草氨酸鹽濃度增加，增殖抑制明顯增加，呈劑量依賴性，不含血清培養(yǎng)時(shí)抑制作用高于含血清組(P<0.01)，；Hochest 及PI 染色、流式細(xì)胞儀檢測(cè)均表現(xiàn)細(xì)胞凋亡比例逐漸增高，且呈劑量依賴性(P<0.01)。
　　 結(jié)論：草氨酸鹽能夠顯著抑制人胰腺癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，有可能成為治療胰腺癌的新靶點(diǎn)。

6、
　　 第三部分：體外抑制劑對(duì)胰腺癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制的研究
　　 目的：研究探討乳酸脫氫酶抑制劑-草氨酸鹽(oxamate)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞PANC-1 凋亡的可能機(jī)制。
　　 方法：體外培養(yǎng)人胰腺癌細(xì)胞PANC-1，不同濃度草氨酸鹽(0mol/L，0.02mol/L，0.04mol/L，0.06mol/L，0.08 mol/L，0.1mol/L)作用panc-1細(xì)胞48h，流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；鈣離子熒光指

7、示劑Fluo-3/AM 染色，激光共聚焦下觀察不同濃度草氨酸鹽作用下細(xì)胞內(nèi)鈣含量的變化；羅丹明123(Rhodamine 123,Rh123)單染、Rh123 聯(lián)合PI 雙染聯(lián)合檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位的變化；
　　 結(jié)果：草氨酸鹽干預(yù)胰腺癌細(xì)胞48h后，細(xì)胞凋亡比例逐漸增高，細(xì)胞內(nèi)鈣含量隨著草氨酸鹽濃度的升高，熒光強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，呈劑量—效應(yīng)關(guān)系；0.02mol/L～0.06mol/L的草氨酸鹽干預(yù)時(shí)，羅丹明單染顯示細(xì)胞線粒體膜電

8、位逐漸增高，而0.08mol/L～0.1mol/L的草氨酸鹽時(shí)，線粒體膜電位則出現(xiàn)明顯下降的趨勢(shì)，Rh123-/PI-細(xì)胞百分比明顯增加(p<0.05)，0.1mol/L時(shí)已為(8.94±0.13)%；
　　 結(jié)論：糖酵解抑制劑-草氨酸鹽能夠有效的誘導(dǎo)胰腺癌PANC-1細(xì)胞的凋亡。草氨酸鹽可能通過(guò)增加胰腺癌細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡，低濃度組主要通過(guò)抑制細(xì)胞能量代謝而誘導(dǎo)凋亡，而0.08mol/L和0.1mol/L的

9、高濃度組還可能通過(guò)降低細(xì)胞線粒體膜電位，進(jìn)而激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)其凋亡。
　　 第四部分：LDH-A shRNA對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖凋亡和LDH-A表達(dá)、乳酸脫氫酶活性的影響
　　 目的：腫瘤組織糖酵解增強(qiáng)，而乳酸脫氫酶催化丙酮酸氧化生成乳酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，乳酸脫氫酶A(lactate Dehydrogenase,LDH-A)與乳酸脫氫酶B(LDH-B)基因分別編碼M 亞基和H 亞基，M、H 亞基比例不同而表現(xiàn)

10、為同工酶LDH1-5。本研究通過(guò)構(gòu)建LDH-A shRNA，轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，分析其對(duì)胰腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　 方法：構(gòu)建3條LDH-A shRNA 質(zhì)粒，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒至PANC-1細(xì)胞中，實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后LDH-A mRNA的表達(dá)變化。將抑制效率最高的shRNA質(zhì)粒-3轉(zhuǎn)染PANC-1細(xì)胞，MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化。RT-PCR檢測(cè)LDH-A表達(dá)以及

11、酶化學(xué)染色檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LDH活性的變化。
　　 結(jié)果：3種LDH-A shRNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞后，LDH-A shRNA 質(zhì)粒-3的2-△△Ct值為(0.47±0.02)，較正常細(xì)胞的(0.71±0.01)小，存在抑制作用，且抑制效率較最高。
　　 PANC-1細(xì)胞在轉(zhuǎn)染shRNA 質(zhì)粒-3后12h 就出現(xiàn)轉(zhuǎn)染組吸光度值顯著低于對(duì)照組，細(xì)胞出現(xiàn)增殖抑制，24h、36h、48h和72h，轉(zhuǎn)染組的吸光度值均顯著低于對(duì)照