人α防御素-5多肽抗單純皰疹Ⅱ型病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、單純皰疹Ⅱ型病毒(herpes simplex virus type2，HSV-2)是一種常見的性傳播病毒，生殖道是其主要的感染和侵入部位。HSV-2感染與先天性畸型、流產(chǎn)、宮頸癌等多種疾病相關(guān)，嚴(yán)重危害著人類健康，而現(xiàn)有的抗病毒藥物由于作用靶點(diǎn)較為單一，常發(fā)生HSV病毒耐藥現(xiàn)象。因此，尋找新型、高效抗HSV病毒藥物具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 防御素(Defensins)是一類內(nèi)源性陽(yáng)離子多肽，具有廣譜抗病原微生物活性以及毒副作

2、用小和病原體不易對(duì)其產(chǎn)生耐藥等特點(diǎn)，有望被研發(fā)成為新一代的抗菌/抗病毒藥物。根據(jù)分子內(nèi)二硫鍵的連接方式、前體性質(zhì)以及表達(dá)部位的差異，哺乳動(dòng)物防御素可分為α、β和θ防御素3種類型。目前在人體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)6種α防御素，根據(jù)表達(dá)部位和細(xì)胞來(lái)源的不同又分為髓源性和腸源性α防御素。人α防御素-5(human defensin5，HD-5)最初被認(rèn)為主要由腸道Paneth細(xì)胞合成和分泌，但后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在女性生殖道粘膜和男性尿道粘膜上皮也有HD-5的特異

3、性表達(dá)。正是由于這些部位經(jīng)常受到細(xì)菌和病毒等病原微生物的侵入，由環(huán)境壓力造成的進(jìn)化選擇使得HD-5較其它防御素具有更為突出的抗病原微生物活性。正因如此，HD-5在細(xì)菌及病毒感染防治方面具有很好的應(yīng)用前景，尤其是人們對(duì)于其在防治性傳播病毒感染方面寄予了厚望。但有關(guān)HD-5的抗HSV-2感染作用機(jī)制還缺乏深入系統(tǒng)的研究。
　　 為此，本文采用常規(guī)病毒顆粒制備、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞病變觀察(CPE)、CCK-8分析、HSV-2感染致豚鼠生殖

4、器皰疹模型等方法，從體內(nèi)和體外兩個(gè)方面觀察了HD-5多肽的抗HSV-2作用；同時(shí)還觀察了血清及血清相關(guān)蛋白對(duì)HD-5多肽抗HSV-2作用的影響。具體內(nèi)容包括：HSV-2病毒的制備及病毒滴度測(cè)定，CCK-8法和溶血試驗(yàn)檢測(cè)HD-5多肽的細(xì)胞毒性，確定細(xì)胞無(wú)毒范圍；然后以體外培養(yǎng)的Vero細(xì)胞為感染對(duì)象，從病毒粘附、侵入及復(fù)制等不同環(huán)節(jié)探討HD-5多肽的抗HSV-2作用及其可能機(jī)制；同時(shí)，觀察不同濃度血清對(duì)HD-5抗HSV-2作用的影響，并

5、分析血清白蛋白和胎球蛋白對(duì)HD-5抗病毒活性的抑制作用，探尋血清干擾HD-5功能發(fā)揮的主要原因；建立HSV-2感染致豚鼠生殖器皰疹動(dòng)物模型，以豚鼠體重、存活率及存活時(shí)間、外陰癥狀變化為檢測(cè)指標(biāo)，觀察體內(nèi)應(yīng)用HD-5多肽對(duì)HSV-2感染的救治作用。
　　 本文取得了以下主要研究結(jié)果及結(jié)論：
　　 (1)成功復(fù)制并鑒定HSV-2病毒，測(cè)定病毒滴度為TCID50=10-3.8。
　　 (2)在濃度<100μg/ml范圍

6、內(nèi)，HD-5多肽不會(huì)對(duì)Vero細(xì)胞的存活和增殖產(chǎn)生顯著影響，顯微鏡下也未發(fā)現(xiàn)Vero細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。
　　 (3)與完全溶血組比較，不同稀釋度的HD-5多肽對(duì)小鼠紅細(xì)胞均無(wú)溶血反應(yīng)。
　　 (4)在病毒感染Vero細(xì)胞之前或同時(shí)加入HD-5多肽，可以劑量賴性地抑制HSV-2感染引起的細(xì)胞病變，在濃度為100μg/ml時(shí)，HD-5對(duì)HSV-2感染Vero細(xì)胞的保護(hù)率分別達(dá)到83.6±4.3％和89.4±3.3%；而在

7、HSV-2感染2h后加入HD-5多肽對(duì)Vero細(xì)胞的保護(hù)作用不明顯(P>0.05)，提示HD-5在體外具有突出的抗HSV-2感染活性，其作用機(jī)制主要是通過(guò)抑制病毒對(duì)細(xì)胞的粘附、侵入而發(fā)揮作用。
　　 (5)在體外抗病毒實(shí)驗(yàn)體系中加入血清時(shí)，HD-5多肽的抗HSV-2活性顯著受到抑制，血清濃度越高，對(duì)HD-5活性的抑制作用越明星；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的白蛋白和胎球蛋白也可以顯著抑制HD-5的抗HSV-2活性，提示血清可以干擾H