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文檔簡介
1、一、研究背景: 生殖器皰疹(Genital Herpes,GH)是由單純皰疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)感染生殖器和肛門部位皮膚、粘膜而引起的一種慢性、易復(fù)發(fā)、難治愈的性傳播疾病。對于這種在人群廣泛流行、有潛在嚴重危害的病毒感染,目前卻沒有特效藥物治療。生殖器皰疹的病原體90%為HSV—2,10%為HSV-1。HSV基因組為一線性雙鏈DNA分子,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的形成可有時序上的先后,美國學(xué)者Roizman根
2、據(jù)基因表達時序的不同,將HSV的基因分為立即早期、早期、晚期基因,分別稱為α、β、γ基因,分別編碼立即早期蛋白、早期蛋白及晚期蛋白。立即早期基因的轉(zhuǎn)錄出現(xiàn)在病毒DNA復(fù)制之前,調(diào)節(jié)著β、γ基因的表達。迄今為止,人們已知的HSV編碼的立即早期蛋白有五個,它們被稱為感染細胞多肽分子(infected cell polypeptides,ICPS)。包括ICPO,ICP4,ICP22,ICP27和ICP47。從位置上看,α27基因又稱為UL5
3、4,它編碼的ICP27具有復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用,是唯一能在皰疹病毒的每個亞科找到其同源蛋白的α蛋白。 RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是近年來一種發(fā)展快并有應(yīng)用前景的基因控制技術(shù)。雙鏈RNA能夠被一種稱為Dicer的RNA酶加工成小分子干擾RNA(small interference RNA,siRNA),隨后這些小干擾RNA與蛋白因子形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA—induced silencing
4、 complex,RISC),該復(fù)合物可以識別并降解與siRNA具有同源序列的mRNA。RNAi作用具有高度的序列特異性,這種特異性抑制基因表達并使表現(xiàn)型喪失的方法類似于基因敲除的效果,故RNAi已成為研究基因功能的重要工具。自從2002年第一次報道RNAi在哺乳動物細胞中能抑制病毒復(fù)制以來,RNAi已經(jīng)廣泛用于各種抗病毒研究,并取得大量令人振奮的結(jié)論。在國際上,針對HSV的RNA干擾治療研究起步相對較晚。到目前為止,可查閱的國內(nèi)外使用
5、RNAi技術(shù)治療HSV—2感染文獻不超過10篇,且絕大部分來自歐美國家。2006年,Palliser等發(fā)現(xiàn),小鼠陰道宮頸粘膜上皮能攝取脂質(zhì)體包裹的siRNA,被攝取的siRNA在局部能產(chǎn)生效果。體外實驗中,針對某些靶基因篩選出有效抑制HSV—2的siRNA;轉(zhuǎn)到體內(nèi)實驗,在陰道粘膜使用含siRNA的制劑,保護了受致死劑量HSV—2攻擊的小鼠。這些結(jié)果顯示了使用RNA干擾技術(shù)治療HSV感染的可能性、有效性以及矚目的前景。 HSV
6、—2病毒感染的周期以及其中有關(guān)的重要基因的表達特性是學(xué)者們選擇siRNA抗病毒靶點的重要依據(jù)。最近研究發(fā)現(xiàn)ICP27為病毒復(fù)制所必需,一旦發(fā)生突變則可能影響晚期基因的表達和DNA的合成。HSV—2具有相對獨立的自身復(fù)制酶系統(tǒng),包括UL30、UL29、UL9、UL42編碼的復(fù)制相關(guān)酶,這些酶直接參與病毒DNA的復(fù)制,而ICP27的缺失可導(dǎo)致這些復(fù)制相關(guān)酶合成減少,影響病毒的復(fù)制;另一方面,在病毒與宿主細胞相互作用的過程中,ICP27通過抑
7、制宿主細胞原始RNA的剪接和加尾等成熟過程,與UL41基因編碼的病毒宿主關(guān)閉蛋白(Virion host shutoff protein,VHS蛋白)共同調(diào)節(jié)宿主mRNA的代謝過程,抑制宿主細胞蛋白的合成。可見,ICP27對于HSV—2來說是個關(guān)鍵的上游蛋白,且對宿主細胞代謝有重要影響,如能夠特異性地干擾ICP27的表達過程,則可能起到抗病毒和保護宿主細胞的作用。因此,本實驗利用RNA干擾技術(shù),研究特異性siRNA對HSV—2復(fù)制的影響
8、,評價UL54基因在病毒復(fù)制中的作用,為確立其作為抗HSV—2的藥物靶標奠定基礎(chǔ),為抗病毒治療提供新方法新思路。 二、研究目的: (1)根據(jù)siRNA設(shè)計原則,篩選UL54基因可能的靶位,合成實驗組siRNA。 (2)探討在RNAi技術(shù)條件下,干擾ICP27合成對HSV—2復(fù)制的影響及對宿主細胞的保護作用,為有效抗病毒治療提供依據(jù)。 (3)篩選有效和特異性抑制UL54表達的siRNA分子。 (4)
9、評價UL54基因在HSV—2復(fù)制中的作用,為確立UL54基因作為抗HSV—2的藥物新靶標奠定基礎(chǔ)。 三、材料與方法: 1.實驗材料:HSV—2病毒懸液;vero細胞株;六對siRNA(四對針對UL54基因的實驗組siRNA: R1、R2、R3、R4;陽性組siRNA;陰性組siRNA)、帶有FAM標記熒光的siRNA(FAM—siRNA)。 2.細胞培養(yǎng)和傳代:傳代細胞株vero細胞用含10%胎牛血清的低糖DME
10、M培養(yǎng)基進行培養(yǎng),待細胞長到致密單層時,進行消化傳代。 3.病毒增殖:vero細胞長成單層后,接種病毒,加入病毒維持液,每天觀察,80%細胞出現(xiàn)病變后,反復(fù)凍融三次,收獲病毒。 4.siRNA的設(shè)計和合成:檢索Genebank查找UL54的基因,分析其保守序列,篩選出靶序列,化學(xué)合成法合成四對實驗組siRNA和陽性、陰性對照siRNA。 5.siRNA轉(zhuǎn)染:用FAM—siRNA進行優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件;以獲得較高轉(zhuǎn)染率的
11、轉(zhuǎn)染條件進行實驗組的siRNA轉(zhuǎn)染。 6.病毒的感染:轉(zhuǎn)染了siRNA的六組細胞和未進行轉(zhuǎn)染的空白組細胞分別接種每孔100TCID50/100μl的HSV—2,分別于接種后12h、24h、36h、48h、60h、72h觀察紀錄細胞病變情況,并收集上清液進行病毒滴度測定。 7.病毒滴度測定:在96孔板中進行病毒液的系列倍比稀釋,按Reed—Mrench法計算,能引起50%培養(yǎng)細胞發(fā)生病變(++)的病毒最高稀釋度(TCID5
12、0)即病毒滴度。 8.MTT比色法測細胞活力:細胞傳代接種至96孔培養(yǎng)板,轉(zhuǎn)染了siRNA和未轉(zhuǎn)染的空白組,于病毒感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h進行MTT比色法測定各組細胞的存活情況。 9.統(tǒng)計學(xué)處理:采用兩獨立樣本t檢驗、隨機區(qū)組方差分析,在SAS8.0系統(tǒng)完成。P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。 四、結(jié)果: 1.合成了實驗用的六對雙鏈siRNA。24孔培養(yǎng)扳中,按1μ/孔Lipofect
13、amine2000,2μ/孔(40nM)的FAM—siRNA轉(zhuǎn)染的細胞孔,熒光效果最好,流式細胞學(xué)檢測轉(zhuǎn)染效率達到70-90%,轉(zhuǎn)染效果好。 2.針對UL54基因的siRNA轉(zhuǎn)染組在病毒復(fù)制早期(12-24小時)即已經(jīng)出現(xiàn)明顯的病毒滴度較空白組降低;病毒復(fù)制晚期,各組病毒滴度僅稍微降低。 3.各轉(zhuǎn)染了特異性siRNA的細胞較空白組細胞病變出現(xiàn)遲,MTT比色法測得OD值較空白組高,細胞存活情況較好。 4.其中,R2
14、和R4組在病毒復(fù)制早期到晚期病毒滴度均較其它組低,細胞病變出現(xiàn)也較遲。 五、結(jié)論: 1.根據(jù)siRNA設(shè)計原則設(shè)計合成的實驗組siRNA,在合適的轉(zhuǎn)染條件下,能夠得到較好的轉(zhuǎn)染率。 2.UL54基因特異性siRNA干擾ICP27的合成,能夠抑制病毒的復(fù)制,降低子代病毒滴度,同時對宿主細胞具有保護作用,細胞病變和壞死少。這為siRNA治療HSV—2感染提供初步理論依據(jù)。 3.按照同樣的設(shè)計原則合成siRNA
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