梔子提取物T9、TH抗單純皰疹病毒1型作用機理研究.pdf

1、病毒性疾病對人類的危害日趨嚴(yán)重，原有病毒病的死灰復(fù)燃及新增病毒病的不斷出現(xiàn)，為世界醫(yī)學(xué)界帶來極大的挑戰(zhàn)。雖然疫苗在以往控制病毒性疾病中發(fā)揮了極大的作用，但由于多種原因使得疫苗的研制受到極大的限制。而現(xiàn)有的抗病毒化療藥物不僅療效不確切，達不到廣譜高效的效果，易產(chǎn)生抗藥性，而且在殺滅病毒的同時嚴(yán)重干擾正常細(xì)胞代謝而顯示出明顯的毒副作用，同樣臨床應(yīng)用受限，發(fā)展緩慢。因此尋找安全、有效的抗病毒手段迫在眉睫。 中藥治療病毒性疾病有幾千年的

2、歷史，具有高效、廣譜、低毒和療效相對穩(wěn)定等優(yōu)點，且中草藥自然資源豐富、品種繁多。但中藥抗病毒的機理仍未被真正認(rèn)識，因而限制了其開發(fā)應(yīng)用。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和新的模型在大規(guī)?？共《舅幬锖Y選中的應(yīng)用，為抗病毒藥物的開發(fā)提供了廣闊的前景，因而也為從中藥中尋找有效的抗病毒成分及揭示其機理提供了極好的條件。 本課題在原有研究工作的基礎(chǔ)上，篩選出具有明顯抗HSV活性的梔子提取物T9、TH，并探討其抗單純皰疹病毒的作用靶點；為揭示中藥的

3、抗病毒機理、開發(fā)針對性治療HSV并具有自主知識產(chǎn)權(quán)的現(xiàn)代中藥奠定堅實的基礎(chǔ)。 一、梔子提取物T9、TH對單純皰疹病毒1型VP16的影響VP16是HSV-1的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒復(fù)制晚期參與病毒顆粒的組裝，同時又作為重要的功能蛋白在病毒感染早期發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能。VP16基因的表達已經(jīng)被看作是單純皰疹病毒復(fù)制發(fā)生的標(biāo)志之一。正是由于VP16在HSV-1感染中的重要作用，本實驗采用對皰疹病毒易感的BALB/C小鼠，以HSV-VP16

4、為研究對象，用RT-PCR方法，半定量比較不同組別間HSV-VP16 mRNA水平，VP16 mRNA的相對表達量以“VP16光密度值/β-actin光密度值”表示，探討梔子提取物T9、TH抗單純皰疹病毒1型的作用機理。結(jié)果顯示：病毒對照組在感染后第4天即可檢出VP16 mRNA的表達，且隨時間呈上升趨勢，在感染后第10天達高峰，以后逐漸下降。T9、TH兩個劑量采用口服和腹腔注射2種途徑給藥后均可明顯降低小鼠腦內(nèi)VP16 mRNA的表達

5、，其總體趨勢表現(xiàn)為：2種給藥途徑均為大劑量組優(yōu)于小劑量組；口服給藥明顯優(yōu)于腹腔注射給藥；T9優(yōu)于TH。說明梔子提取物T9、TH能夠使單純皰疹病毒感染小鼠腦內(nèi)VP16 mRNA相對表達量降低，可能是它們抗單純皰疹病毒的作用機理之一。目前國內(nèi)外未見作用于這一靶點藥物的報道。 二、梔子提取物T9、TH對感染HSV-1小鼠腦內(nèi)IFN-γ的影響IFN-γ是清除HSV的一種必要的免疫因子。被病毒感染后，激活的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生大量IFN-

6、γ，IFN-γ刺激病毒感染的細(xì)胞表達MHC I類分子，促進CTL殺傷病毒感染細(xì)胞，同時也增強N K細(xì)胞的殺傷病毒感染細(xì)胞活性。IFN-γ無論在天然免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要作用。本實驗采用RT-PCR技術(shù)，觀察不同組別之間HSV-1感染的BALB/C小鼠腦內(nèi)IFN-γ隨時間的變化情況，旨在探討梔子提取物T9、TH抗單純皰疹病毒1型在免疫方面的作用機理。結(jié)果顯示：病毒對照組在感染后第4天即可明顯檢測出IFN-γ mRNA的表達，且在感染

7、后第4天至第10天內(nèi)呈現(xiàn)平穩(wěn)的表達；10天后工FN-γ mRNA相對表達量開始下降；第14天后和感染初期相比呈現(xiàn)相對平穩(wěn)的低水平表達。T9、TH兩個劑量采用口服和腹腔注射2種途徑給藥后均可明顯上調(diào)小鼠腦內(nèi)IFN-γ mRNA的表達，梔子提取物T9各給藥組中除T9口服小劑量組外，其余各組在感染后7天達高峰，并且在感染后21天內(nèi)仍然平穩(wěn)表達；T9口服小劑量組在感染后14天達高峰，且表達量高于其余給藥組。梔子提取物TH各給藥組中，口服給藥組均

8、在第10天達高峰，注射給藥組均在第14天達高峰。說明梔子提取物T9、TH能夠通過某種機制上調(diào)單純皰疹病毒感染小鼠腦內(nèi)IFN-γmRNA相對表達量，可能是它們抗單純皰疹病毒的又一作用機理。 三、梔子提取物T9、TH對單純皰疹病毒1型膜受體運動的影響利用單個微粒運動觀察的方法對病毒感染及給藥前后膜表面受體運動的研究可以對膜的結(jié)構(gòu)功能及藥物的作用靶點做出更深刻的解釋。本實驗采用容易培養(yǎng)的HEP-2細(xì)胞，研究單純皰疹病毒1型及不同加藥方

9、式感染細(xì)胞的運動狀態(tài)，并試圖以此揭示細(xì)胞膜的一些性質(zhì)及藥物的作用機理。配體為F-HSV復(fù)合體，被標(biāo)記的HSV與細(xì)胞膜表面HSV受體結(jié)合，使用熒光顯微鏡觀測，用一個相增強的cCCD實時記錄。并開發(fā)了一套細(xì)胞顯微觀測系統(tǒng)軟件——單個微粒運動觀察技術(shù)SPT(single particle tracking)技術(shù)，對實時圖像進行單粒子追蹤、軌跡分析和數(shù)據(jù)分析。同時用Aquacomos軟件對同一時間不同組別圖像的熒光強度進行處理，計算各組的吸附率

10、及抑制率。結(jié)果顯示：由于所選用的熒光探針FITC淬滅快，因此跟蹤受體運動的時間短，病毒對照組受體運動的位移不大，其余加藥組用該軟件檢測不到受體的運動。目前我課題組仍在繼續(xù)尋找適合觀察單純皰疹病毒1型受體運動的熒光探針，其應(yīng)不僅具有易與病毒結(jié)合的特性，同時又能減小自淬滅以保證掃描的時間。相關(guān)的試驗還在進行中。對各組圖像熒光強度的處理顯示，梔子提取物T9、TH不同加藥方式均能阻止HSV-1對HEP-2細(xì)胞表面的吸附，使病毒吸附量減少。說明梔