靶向UL5的siRNA對(duì)Ⅱ型單純皰疹病毒抑制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：應(yīng)用RNA干擾技術(shù)研究靶向II型單純皰疹病毒UL5基因的siRNA對(duì)病毒的干擾作用。
　　 方法：在GeneBank上查找HSV-2 UL5基因全序列，使用siRNA在線設(shè)計(jì)軟件對(duì)UL5的靶基因序列進(jìn)行初步篩選；對(duì)候選靶mRNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析以及脫靶分析。用BLAST分析排除與其它基因有高度同源性的序列。本實(shí)驗(yàn)從UL5基因中篩選出了五條序列作為靶序列并由靶序列分別設(shè)計(jì)合成出對(duì)應(yīng)的正、反義寡核苷酸。siR

2、NA通過轉(zhuǎn)染載體LipofeCtamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染12小時(shí)后收集并固定細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果。收集轉(zhuǎn)染48小時(shí)后的細(xì)胞進(jìn)行熒光定量RT-PCR和病毒滴度檢測(cè)，觀察其干擾效果。
　　 結(jié)果：Cy3熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞12小時(shí)后，收集細(xì)胞在熒光顯微鏡下可見熒光小點(diǎn)，而未轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞未見熒光，說明siRNA已經(jīng)成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)。熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示，siRN

3、A722、siRNA2394、siRNA2513和s1RNA2627均可不同程度降低靶mRNA表達(dá)，siRNA2627抑制效果最好；陰性對(duì)照組和siRNA374對(duì)靶mRNA表達(dá)無影響。病毒滴度檢測(cè)結(jié)果顯示siRNA722、siRNA2394、siRNA2513和siRNA2627均可不同程度降低上清液中病毒感染滴度，陰性對(duì)照組和siRNA374對(duì)病毒感染滴度無影響。
　　 結(jié)論：1、運(yùn)用生物信息學(xué)軟件有助于特異性siRNA的優(yōu)化