EGR1在HTLV-1感染細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制及功能研究.pdf

1、目的：
　　HTLV-1編碼的癌蛋白Tax被認(rèn)為是導(dǎo)致病毒感染后宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素，本小組前期通過基因芯片分析穩(wěn)定表達(dá)癌蛋白Tax的細(xì)胞系TaxP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了10個高表達(dá)和38個低表達(dá)的基因，高表達(dá)基因中包括早期反應(yīng)生長因子1（EGR1）。本研究旨在對TaxP細(xì)胞中EGR1的表達(dá)特性、生物學(xué)作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。
　　方法：
　　1.EGR1在Tax蛋白陽性細(xì)胞中的表達(dá)
　　(1)HTLV-1陽性T細(xì)胞中

2、EGR1的表達(dá)選用HTLV-1陰性T細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞、MOLT4細(xì)胞；HTLV-1陽性T細(xì)胞系MT2細(xì)胞和MT4細(xì)胞，western blot和real-time PCR檢測EGR1 mRNA和蛋白的表達(dá)；
　　(2)Tax蛋白對T細(xì)胞中EGR1表達(dá)的影響選用穩(wěn)定表達(dá)Tax蛋白的細(xì)胞系TaxP及其對照細(xì)胞系TaxN，或者通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染不同量的Tax質(zhì)粒，western blot和real-time PCR檢測EGR

3、1 mRNA和蛋白的表達(dá)；
　　(3)HTLV-1感染對宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)的影響將 HTLV-1陽性 T細(xì)胞MT2與hela細(xì)胞或Jurkat按照1:5共培養(yǎng)，檢測EGR1 mRNA和蛋白的表達(dá)。
　　2.Tax蛋白陽性細(xì)胞中EGR1表達(dá)調(diào)控特性分析
　　(1)構(gòu)建不同長度的EGR1報告基因及其突變體以jurkat細(xì)胞基因組為模板，擴(kuò)增EGR1調(diào)控序列全長993bp，構(gòu)建Pgl3-EGR1-luc(E1)，利用E1構(gòu)

4、建截短體 E2(-423bp~+1bp)、E3(-223bp~+1bp)；委托上海生工構(gòu)建 NFκB結(jié)合位點NBS(-422bp~-401bp)缺失和點突變的調(diào)控序列，分別標(biāo)記為DelE和MutE。
　　(2)報告基因活性分析將不同長度的EGR1報告基因及其突變體，與參照載體Prl-luc和p65 shRNA或?qū)φ蛰d體共同轉(zhuǎn)染TaxP細(xì)胞和MT2細(xì)胞，檢測EGR1調(diào)控序列熒光素酶報告基因的相對活性。
　　(3)HTLV-1感

5、染對報告基因活性的影響將 EGR1報告基因及其突變體，與參照載體Prl-luc和p65 shRNA或?qū)φ蛰d體共同轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞和jurkat細(xì)胞，轉(zhuǎn)染結(jié)束后，加入1/5數(shù)量的MT2細(xì)胞，檢測熒光素酶報告基因的相對活性。
　　(4)染色體共沉淀檢測p65直接結(jié)合EGR1調(diào)控序列收集MT2細(xì)胞，利用染色體共沉淀檢測p65直接結(jié)合EGR1調(diào)控序列。
　　3.p65介導(dǎo)的EGR1表達(dá)分析:
　?。?）NFκB抑制劑BAY11

6、-7082對EGR1表達(dá)的影響在MT2細(xì)胞和TaxP細(xì)胞上清中加入BAY11-7082或轉(zhuǎn)染p65 shRNA，檢測EGR1和p65蛋白的表達(dá)
　?。?）不同Tax突變體對宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)的影響將Tax突變體M22、M47和野生型Tax，轉(zhuǎn)染hela細(xì)胞，檢測EGR1蛋白的表達(dá)；將EGR1熒光素酶報告基因分別與M22、M47和Tax轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，檢測EGR1調(diào)控序列活性。
　　4.EGR1對HTLV-1感染細(xì)胞中RE

7、LA表達(dá)的影響及機(jī)制探討將EGR1表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)TaxP細(xì)胞和MT2細(xì)胞，檢測EGR1、p65蛋白；將EGR1表達(dá)質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)染TaxP細(xì)胞，觀察EGR1對p65入核的影響；將EGR1表達(dá)質(zhì)粒與NFκB熒光素酶報告基因pNFκB-luc共轉(zhuǎn)TaxP細(xì)胞和MT2細(xì)胞，檢測熒光素酶活性，或者提取核蛋白，利用凝膠電泳遷移率EMSA檢測NFκB結(jié)合DNA的能力。
　　5.EGR1促進(jìn)HTLV-1感染細(xì)胞中NFKB活性機(jī)制探討PHA和PBS刺激J

8、urkat細(xì)胞后加入蛋白合成抑制劑CHX，分別于不同時間段收集細(xì)胞檢測EGR1蛋白的表達(dá)；將Tax質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞24h后加入CHX，檢測EGR1和Tax蛋白的表達(dá)；利用免疫共沉淀技術(shù)，檢測TaxP細(xì)胞中Tax和EGR1的直接作用。
　　6.HTLV-1在Hela細(xì)胞中的復(fù)制動力學(xué)分析將HTLV-1陽性T細(xì)胞MT2按照1:1的比例加入Hela細(xì)胞，1h后反復(fù)吹吸去除懸浮細(xì)胞后，收集不同時間段的細(xì)胞，western blot

9、檢測核心抗原p19表達(dá)，real-time PCR檢測病毒核酸拷貝。
　　7.EGR1調(diào)控HTLV-1感染的機(jī)制分析
　　(1)HTLV-1感染后對宿主細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響利用細(xì)胞共培養(yǎng)模型模擬病毒早期感染，檢測病毒感染后Hela細(xì)胞Cas3/9的活性和活性蛋白的變化。
　　(2)HTLV-1感染后對宿主細(xì)胞細(xì)胞自噬的影響利用細(xì)胞共培養(yǎng)模型模擬病毒早期感染，檢測LC3B的表達(dá)；將LC3B-EGFP載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)

10、染結(jié)束后進(jìn)行細(xì)胞共培養(yǎng)，共聚焦顯微鏡檢測自噬體數(shù)目。
　　(3)干擾EGR1對HTLV-1復(fù)制動力學(xué)的影響將EGR1 siRNA轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h后，加入等數(shù)量的MT2細(xì)胞共培養(yǎng)，western blot檢測病毒感染后Hela細(xì)胞Cas3/9的活性、Cas3/cas9、LC3B、p19蛋白的表達(dá)、以及病毒核酸拷貝。
　　結(jié)果：
　　1.EGR1在Tax蛋白陽性細(xì)胞中的表達(dá)
　　(1)HTLV-1陽性T細(xì)

11、胞中EGR1的表達(dá)檢測發(fā)現(xiàn)HTLV-1陽性T細(xì)胞系中EGR1 mRNA和蛋白的表達(dá)至少比對照細(xì)胞系HTLV-1陰性T細(xì)胞系高出近3倍，差異明顯(P＜0.01)，表明HTLV-1感染可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)升高。
　　(2)Tax蛋白對T細(xì)胞中EGR1表達(dá)的影響檢測發(fā)現(xiàn)TaxP細(xì)胞中EGR1 mRNA和蛋白對照細(xì)胞系TaxN細(xì)胞高出近3倍，瞬時轉(zhuǎn)染 Tax質(zhì)粒后，EGR1 mRNA和蛋白的表達(dá)也隨著增高，差異均明顯(P＜0.01

12、)，且隨著質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的升高而升高，這些結(jié)果均表明癌蛋白Tax可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞EGR1的表達(dá)升高。
　　(3)HTLV-1感染對宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)的影響隨著共培養(yǎng)體系中加入的MT2細(xì)胞比例增大，癌蛋白Tax也隨著增高，同時EGR1 mRNA和蛋白的表達(dá)也明顯增高，結(jié)果提示病毒早期感染也可以導(dǎo)致宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)升高。
　　2.Tax蛋白陽性細(xì)胞中EGR1表達(dá)調(diào)控特性的分析
　　(1)構(gòu)建不同長度的EGR1報告基因及其

13、突變體成功構(gòu)建EGR1全長報告基因E1以及截短體E2、E3和NBS缺失的DelE和-413/T-G點突變的MutE。
　　(2)報告基因活性分析將EGR1報告基因與p65 shRNA轉(zhuǎn)染TaxP細(xì)胞和MT2細(xì)胞后，檢測發(fā)現(xiàn)E1、E2的熒光素酶活性明顯高于E3、DelE和MutE，而與p65 shRNA共轉(zhuǎn)染后明顯低于對照載體組E1和E2的熒光素酶活性。提示調(diào)控EGR1表達(dá)的區(qū)域主要位于-422~-401bp的NFκB結(jié)合位點。

14、r>　　(3)染色體共沉淀檢測p65直接結(jié)合EGR1的調(diào)控序列染色體共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)p65可以直接結(jié)合EGR1的調(diào)控序列，區(qū)間位于-505bp~-223bp。
　　3.p65介導(dǎo)的EGR1表達(dá)分析
　?。?）NFκB抑制劑BAY11-7082對EGR1表達(dá)的影響應(yīng)用p65 shRNA沉默p65后，MT2細(xì)胞和TaxP細(xì)胞中EGR1的表達(dá)下降將近一倍，同樣地應(yīng)用NFκB抑制劑BAY11-7082后，EGR1的表達(dá)下調(diào)近60％。<

15、br>　?。?）不同Tax突變體對宿主細(xì)胞EGR1表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染野生型Tax和突變體M47組，EGR1的蛋白表達(dá)和E1、E2熒光素酶報告基因活性明顯高于M22組（P＜0.05），而E3、DelE、MutE活性差異不明顯（P＞0.05），說明了不能激活NFκB途徑的突變體M22促進(jìn)EGR1表達(dá)的能力明顯受損。
　　4.EGR1對 HTLV-1感染細(xì)胞中RELA表達(dá)的影響及機(jī)制的探討發(fā)現(xiàn)EGR1可以促進(jìn)TaxP細(xì)胞和MT2細(xì)胞p6

16、5蛋白的表達(dá)和NFκB的活性，且隨著劑量增加而增加，EGR1還可以促進(jìn)p65蛋白入核和促進(jìn)NFκB結(jié)合DNA的能力，提示Tax蛋白陽性細(xì)胞中EGR1和NFκB存在著正反饋調(diào)節(jié)。
　　5.EGR1促進(jìn)HTLV-1感染細(xì)胞中NFκB活性的機(jī)制探討在Tax存在條件下EGR1蛋白的半衰期延長；免疫共沉淀技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)Tax蛋白和EGR1蛋白存在著直接作用，這提示HTLV-1可能是通過Tax蛋白延長EGR1蛋白的半衰期造成蛋白蓄積，導(dǎo)致宿主細(xì)

17、胞中EGR1和NFκB的正反饋性持續(xù)活化。
　　6.HTLV-1在Hela細(xì)胞中的復(fù)制動力學(xué)分析細(xì)胞共培養(yǎng)模型檢測發(fā)現(xiàn)4h可以檢測到HTLV-1核心蛋白p19的表達(dá)，但是8h時表達(dá)下降，隨后逐漸升高；real-time PCR檢測顯示病毒核酸拷貝隨著時間增加而逐漸增加。
　　7.EGR1調(diào)控HTLV-1感染的機(jī)制分析
　　(1)HTLV-1感染后對宿主細(xì)胞細(xì)胞凋亡的影響HTLV-1感染hela細(xì)胞后， cas3/7、c

18、as9的活性和活化的cas3/9均無差異，提示病毒感染后不能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　(2)HTLV-1感染后對宿主細(xì)胞細(xì)胞自噬的影響HTLV-1感染Hela細(xì)胞后，LC3B的表達(dá)和自噬體數(shù)目明顯高于未感染組(0h)，且隨著時間增加LC3B表達(dá)逐漸增強(qiáng)（P＜0.05），提示HTLV-1感染可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞自噬。
　　(3)干擾EGR1對HTLV-1復(fù)制動力學(xué)的影響宿主細(xì)胞中，用siRNA沉默EGR1后，檢測顯示Cas3/9活性和活性

19、Cas3/9蛋白的表達(dá)沒有差異，而自噬蛋白LC3B、HTLV-1核心蛋白p19的表達(dá)都明顯降低，免疫熒光也發(fā)現(xiàn)自噬體數(shù)目減少，提示EGR1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬參與HTLV-1在宿主細(xì)胞中的復(fù)制動力學(xué)。
　　結(jié)論：
　　1.HTLV-1感染宿主細(xì)胞中EGR1的高表達(dá)調(diào)控受NFκB調(diào)控。
　　2.EGR1和NFκB之間存在著正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，癌蛋白Tax可以通過直接結(jié)合EGR1延長EGR1蛋白的半衰期，可能是EGR1和NFκB之