自噬在肝卵圓細胞增殖和分化中的作用研究.pdf

1、目的：
　　通過添加藥物雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）和氯喹（Chloroquine，Chlo）調整肝卵圓細胞的自噬水平，觀察肝卵圓細胞的增殖和分化情況改變。
　　這些：
　　一、雷帕霉素和氯喹對大鼠肝卵圓細胞自噬水平的調控作用
　?。?）用分別用40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹處理肝卵圓細胞24小時后,顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化,western blot檢測自噬相關蛋白LC3-I和L

2、C3-II以及P62的表達。
　　二、自噬對肝卵圓細胞在正常環(huán)境下的增殖和凋亡的影響
　　（1）分別用0（空白對照）、5、10、25、50、100、150、200、300、500μmol/L氯喹，以及25、50、100、200、500nmol/L的雷帕霉素分別處理肝卵圓細胞，每個濃度點設置3個時間點24h、48h、72h，應用CCK-8試劑盒檢測比較肝卵圓細胞的增殖能力變化。
　　（2）用分別用40nmol/L的雷帕霉

3、素和50μmol/L的氯喹處理細胞后，使用流式細胞技術來檢測肝卵圓細胞的細胞周期和凋亡細胞比例。
　　（3）肝卵圓細胞經(jīng)過40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹處理后，分別提取蛋白通過western blot檢測凋亡相關蛋白B淋巴細胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2，BCL-2）和聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（polyADP-ribose polymerase，cleave-PARP）。
　　三、自噬對

4、正常環(huán)境下肝卵圓細胞分化的影響
　?。?）大鼠肝卵圓細胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期,利用丁酸鈉（Sodium butyrate，SB）誘導分化，通過細胞免疫化學技術觀察不同藥物處理組體外誘導分化改變情況。
　?。?）40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹處理實驗組與空白對照組分別提取蛋白，通過Western Blot法檢測角蛋白19(Cytokeratin19，CK19)蛋白水平
　　四、探討自噬調控肝卵圓細胞增殖和

5、分化的可能信號通路
　?。?）用40nmol/L的雷帕霉素和50μmol/L的氯喹藥物處理組和對照組，分別提取蛋白后通過 Western Blot法檢測相關通路NOTCH1胞內(nèi)區(qū)域段(Notch intraCellular domain,NICD)、HES1、HES5蛋白激酶ERK和MAPK(P38)的磷酸化水平。
　　結果：
　　1.雷帕霉素能誘導大鼠肝卵圓細胞發(fā)生自噬，而氯喹能抑制肝卵圓細胞自噬的發(fā)生
　?。?/p>

6、1）雷帕霉素處理后細胞形態(tài)變化不明顯，而氯喹處理組細胞形態(tài)由卵圓形變?yōu)槿切危毎麛?shù)量減少。
　　（2）雷帕霉素處理后，引起LC3-II/LC3-I比值增大，P62減少。
　?。?）氯喹處理組，引起LC3-II/LC3-I比值降低，P62增多。
　　2.自噬對肝卵圓細胞在正常環(huán)境下的增殖和凋亡的影響
　?。?）氯喹處理后，肝卵圓細胞的增殖對氯喹有時間和劑量依賴性。相同處理時間，隨著氯喹濃度的升高，肝卵圓細胞的增殖

7、抑制率逐漸升高；相同處理濃度，隨著處理時間的延長，肝卵圓細胞的抑制率逐漸升高。
　　（2）氯喹處理肝卵圓細胞后，細胞周期SubG1停滯增多，細胞凋亡數(shù)量明顯增多；而雷帕霉素處理組，細胞周期無顯著變化，細胞凋亡數(shù)量輕微降低。
　?。?）雷帕霉素組，引起B(yǎng)CL-2的升高，cleave-PARP降低。
　?。?）氯喹處理組，引起cleave-PARP的升高，BCL-2降低。
　　以上結果表示自噬的抑制能抑制肝卵圓細胞增

8、殖的，并且使肝卵圓細胞的周期停滯，促進凋亡。
　　3.自噬能促進肝卵圓細胞向膽管細胞分化
　?。?）雷帕霉素處理組，相對于對照組，CK19的熒光量明顯增多，兩組均高于正常組。
　?。?）氯喹處理組，相對于對照組，熒光表達量無明顯變化。
　?。?）雷帕霉素處理后相對于正?；蛘邔φ战M，ck19蛋白的表達量顯著提高。
　　以上結果提示自噬能促進肝卵圓細胞向膽管細胞的分化。
　　4.肝卵圓細胞的自噬誘導能改變

9、notch通路和MAPK/ERK通路
　?。?）雷帕霉素能提高MAPK/ERK的磷酸化水平。
　?。?）雷帕霉素能促進NICD、HES1/HES5的表達。以上結果表示自噬可能通過notch通路和MAPK/ERK通路調控肝卵圓細胞的增殖和分化。
　　結論
　　1.自噬的抑制能抑制肝卵圓細胞的增殖，引起周期停滯，促進細胞凋亡。
　　2.自噬能促進肝卵圓細胞的分化。
　　3.自噬對肝卵圓細胞的作用可能通過調