移植腎急性排斥相關免疫基因芯片的構(gòu)建及臨床應用的初步探討.pdf

1、目的：構(gòu)建與免疫基因相關的基因芯片，并利用其篩選出與急性排異反應相關的差異表達基因。對篩選出表達量增高的基因，通過聚類分析，確定高表達基因，并用定量PCR對該高表達基因進行定量分析，從而驗證構(gòu)建基因芯片的穩(wěn)定性及準確性。對具有代表性的基因進行臨床應用的初步研究。 方法：通過自行設計的包含有CD分子、細胞因子、趨化因子、粘附因子、FasL、穿孔素、顆粒酶B等共475個免疫相關基因的基因芯片，對臨床上腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應和非急

2、性排異反應患者進行了研究。以手術(shù)后第四天和移植腎腎穿刺活檢當日/隨訪日收集外周血作為對照血樣和實驗血樣，用Ficoll技術(shù)提取外周血淋巴細胞，并采用一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA探針，熒光染料標記后，與芯片進行雜交，掃描后篩選出差異表達基因。對篩選出表達量增高的基因，通過聚類分析，確定高表達基因，并用定量PCR對該高表達基因進行定量分析。根據(jù)發(fā)現(xiàn)與急性排斥反應相關的基因，初步探討其在移植腎急性排斥反應發(fā)生中的機理；對具有代表性的

3、穿孔素、顆粒酶B、IL-4進行PCR定量，并對穿孔素、顆粒酶B進行臨床應用研究。 結(jié)果：研究發(fā)現(xiàn)外周血淋巴細胞中與急性排斥反應可能相關的免疫基因，篩選出急性排斥反應時表達量出現(xiàn)差異的基因，其中急性排斥發(fā)生時外周血淋巴細胞免疫相關基因差異表達上調(diào)20條，包括：IL-4、IL-6、IL-10、IL-2、IL-15、INF-γ、TNF-α、CD126、CTLA-4、IL-5、IL-13、IL-18、CD40L、Perforin、Gra

4、nzymeB、FasL、MCP1、CD30、HLA-DR、MIP-1。下調(diào)11個基因，包括：TGFB1、RAB5C、RAB6C、RAB10、IL-17、IL-12、CD4、CD47、CD24、CD79B、CD81。而在非急性排異組患者中并沒有發(fā)現(xiàn)上述基因的顯著改變。對其中的穿孔素、顆粒酶B、IL-4進行實時免疫熒光PCR定量驗證，證實他們在急性排異反應時較腎功能穩(wěn)定時出現(xiàn)量上出現(xiàn)顯著性升高(P<0.05)，治療后顯著下降(P<0.05)

5、。 應用實時熒光定量PCR對臨床上38例移植腎急性排異反應和20例移植腎功能穩(wěn)定患者進行研究，發(fā)現(xiàn)應用外周血淋巴細胞的穿孔素mRNA水平來診斷移植腎急性排異反應的敏感度為86.8％，特異度為80％。臨床應用外周血淋巴細胞的顆粒酶mRNA水平來診斷移植腎急性排異反應的敏感度為86.8％，特異度為90％。臨床應用外周血淋巴細胞的IL-4的mRNA水平來診斷移植腎急性排異反應的敏感度為86.8％，特異度為75％。 結(jié)論：本課題

6、通過自行設計的具有475個免疫相關基因的基因芯片，對臨床上腎移植術(shù)后發(fā)生急性排斥反應患者進行了研究。并應用PCR定量驗證，結(jié)果顯示此基因芯片具有良好的穩(wěn)定性、準確性。發(fā)現(xiàn)了外周血淋巴細胞中與急性排斥反應可能相關的免疫基因，篩選出急性排斥反應時表達量出現(xiàn)差異的基因，其中急性排斥發(fā)生時外周血淋巴細胞免疫相關基因差異表達上調(diào)20個、下調(diào)11個。對具有代表性的穿孔素、顆粒酶B、IL-4進行PCR定量，發(fā)現(xiàn)三者在移植腎急性排異反應時明顯升高。臨床