小鼠燒傷后免疫相關(guān)基因芯片數(shù)據(jù)分析及生物標(biāo)志物的初步篩選.pdf

1、背景：
　　燒傷，尤其是大面積燒傷將引起機體一系列的免疫病理生理學(xué)變化，造成機體免疫功能紊亂(immune dysfunction)。燒傷后免疫功能紊亂被認(rèn)為是引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)、嚴(yán)重感染、多器官功能障礙綜合征(MODS)甚至死亡等的重要原因。燒傷后免疫功能紊亂是燒傷后創(chuàng)面疼痛刺激、應(yīng)激(stress)、缺血缺氧(ischemia、hypoxia)及再灌注損傷(reperfusioninjury)等因素激活機體的凝

2、血、纖溶、激肽和補體系統(tǒng)，連同患者自身因素及后續(xù)的各種治療因素一起改變了機體免疫細(xì)胞和免疫分子所處的微環(huán)境，從而導(dǎo)致了免疫功能紊亂的發(fā)生。燒傷后免疫功能紊亂發(fā)生、發(fā)展機制極其復(fù)雜并難以得到有效調(diào)控，它也被認(rèn)為是近年來嚴(yán)重?zé)齻斡孰y以進(jìn)一步提高的主要原因。
　　目前燒傷免疫研究多是對免疫細(xì)胞、免疫因子的作用機制或細(xì)胞凋亡、感染及器官損傷等方面的研究。這些研究或多或少的揭示了燒傷后免疫功能紊亂的發(fā)生機制。但是燒傷后的病理生理學(xué)變化是

3、時間序貫性的，其發(fā)生、發(fā)展機制十分復(fù)雜幾乎涉及所有身體器官和系統(tǒng)。因此，深入研究燒傷后免疫功能紊亂的發(fā)生機制，對了解燒傷后免疫功能紊亂的發(fā)生發(fā)展、尋找治療及診斷的新藥物、提高患者生存質(zhì)量具有深遠(yuǎn)意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，新的研究手段不斷涌現(xiàn)。尤其是在后基因組時代，系統(tǒng)性、整體性越來越受到人們的重視。因此，從基因組層次了解燒傷后的病理生理學(xué)過程將是今后燒傷免疫研究的重點。
　　生物信息學(xué)(Bioinformatics)是生

4、命科學(xué)領(lǐng)域中的新興學(xué)科，面對人類基因組計劃所產(chǎn)生的海量生物學(xué)數(shù)據(jù)，生物信息學(xué)成為當(dāng)代生命科學(xué)研究的一個前沿領(lǐng)域和重要的方法及工具。與生物信息學(xué)相伴發(fā)展的基因芯片技術(shù)是生物技術(shù)領(lǐng)域最重要的進(jìn)展之一，是推動生物學(xué)研究走進(jìn)系統(tǒng)生物學(xué)時代的重要因素和技術(shù)基礎(chǔ)，它使得獲取實驗數(shù)據(jù)的能力大大增強。以基因芯片為代表的高通量分子生物學(xué)技術(shù)，可以一次進(jìn)行成千上萬基因表達(dá)的檢測?；蛐酒吧镄畔W(xué)技術(shù)為燒傷后免疫功能紊亂機制的研究提供新的研究前景，因其高

5、通量的特性，它可以同時檢測數(shù)以千計的基因表達(dá)情況，可以對燒傷后免疫細(xì)胞基因組轉(zhuǎn)錄水平信息進(jìn)行分析，并對研究涉及的基因通路或者基因網(wǎng)絡(luò)、模塊的變化進(jìn)行分析挖掘。基因芯片及生物信息學(xué)技術(shù)為燒傷后免疫功能紊亂機制的研究及診斷提供了新的思路。
　　基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法為從轉(zhuǎn)錄水平或DNA層次全面了解燒傷后復(fù)雜的病理生理學(xué)變化提供了可能。在2010年Lars H.Evers，Dhaval Bhavsar等人就已經(jīng)提出:燒傷后基因

6、表達(dá)分析是未來一個潛在的研究熱點，基因芯片從細(xì)胞整體基因組水平出發(fā)，能為燒傷后免疫紊亂機制的研究提供新的思路及新的治療靶點。因此，進(jìn)行燒傷后基因表達(dá)分析，不僅可以從細(xì)胞整體基因組轉(zhuǎn)錄水平上了解燒傷后一系列的病理生理學(xué)變化，而且可以應(yīng)用基因芯片技術(shù)為臨床治療提供新的治療靶點和思路。
　　目前基因芯片技術(shù)應(yīng)用于燒傷領(lǐng)域的研究已比較常見，2008年JamesA和Lederer等就利用基因芯片技術(shù)對創(chuàng)傷及燒傷后小鼠免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析

7、中發(fā)現(xiàn)燒傷后可引起免疫系統(tǒng)、炎癥反應(yīng)等多個方面的變化。2010年Arul Jayaraman和Robert J等利用基因芯片技術(shù)對人燒傷后基因的序貫性變化做出了初步探究。通過對這些芯片數(shù)據(jù)的初步分析，發(fā)現(xiàn)了許多值得深思及顛覆性的信息，如燒傷與創(chuàng)傷、腫瘤不同;燒傷的時間序貫性強、反應(yīng)更復(fù)雜，涉及炎癥、免疫反應(yīng)、代謝等多方面因素。這些研究揭示了燒傷后免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的變化;并發(fā)現(xiàn)了許多與常規(guī)實驗及臨床研究結(jié)果不同的結(jié)論，如創(chuàng)傷后免疫細(xì)胞基因

8、改變早于4小時發(fā)生并持續(xù)較長時間;燒傷后基因變化是序貫性而且是有序進(jìn)行;燒傷后引起大量炎癥因子釋放，造成免疫細(xì)胞功能抑制，且發(fā)現(xiàn)固有免疫系統(tǒng)與適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能抑制的發(fā)生無先后之分等。
　　但目前大部分基因芯片研究多用于驗證某些基因的表達(dá)情況，這一研究方法缺點較多，芯片數(shù)據(jù)可信度較差，無法進(jìn)行有效的數(shù)據(jù)挖掘與分析?，F(xiàn)階段燒傷相關(guān)的大規(guī)模芯片研究較少，在燒傷免疫方面的研究中更是少見。同時由于燒傷后病理生理學(xué)變化是一個動態(tài)的過程，其發(fā)

9、生、發(fā)展機制不同于腫瘤及其他疾病，其分析方法較為復(fù)雜、特殊?；蛐酒夹g(shù)在燒傷領(lǐng)域的應(yīng)用還處于初始階段，芯片產(chǎn)生的大量的數(shù)據(jù)并未得到很好的利用，且目前尚沒有對燒傷免疫基因芯片產(chǎn)生的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)方面的精細(xì)分析及挖掘。
　　目的：
　　在本次研究中，我們通過系統(tǒng)生物信息學(xué)技術(shù)獲取小鼠燒傷早期不同時間點差異基因表達(dá)譜，并運用生物信息學(xué)方法分別在GO語義、KEGG通路和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中初步探索燒傷后免疫功能改變的分子機制，并篩選

10、潛在的生物靶標(biāo)。旨在初步探索和描述燒傷后免疫細(xì)胞差異表達(dá)譜、病理過程和分子機制;并通過富集分析錨定與燒傷后免疫功能紊亂發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的風(fēng)險基因及通路;為深入研究燒傷后免疫功能紊亂的發(fā)生機制、并篩選早期預(yù)警指標(biāo)和治療靶點提供理論指導(dǎo)和依據(jù)。
　　方法：
　　1 原始數(shù)據(jù)篩選
　　從 NCBI的GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)

11、篩選出GSE7404（小鼠，25％TBSA，三度）數(shù)據(jù)集，GSE7404數(shù)據(jù)是GPL1261平臺Affymetrix Mouse Genome4302.0Array基因芯片。基因芯片數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量評估合格后進(jìn)行下一步數(shù)據(jù)處理。在R語言環(huán)境中應(yīng)用線性模型方法(linear models methods)、經(jīng)驗Bayes算法(empirical Bayes methods)和RSN(Robust Spline Normalizationalg

12、orithm)分別對探針?biāo)降男盘栔颠M(jìn)行質(zhì)控、變異穩(wěn)定性分析、背景矯正、數(shù)據(jù)歸一化和基因注釋，將數(shù)據(jù)最終轉(zhuǎn)化為表達(dá)水平數(shù)據(jù)。
　　2 差異表達(dá)基因的獲取及聚類分析:
　　差異基因獲取采用配對樣本t檢驗，差異基因需同時滿足p-value＜0.01及表達(dá)量變化超過2倍的標(biāo)準(zhǔn)，以確保所獲取的差異基因即有統(tǒng)計學(xué)意義又有生物學(xué)表達(dá)意義。同時通過無監(jiān)督聚類分析將差異基因進(jìn)行分類。
　　3 功能富集分析
　　在本次研究中，為我

13、們應(yīng)用GO-function數(shù)據(jù)包可以對基因進(jìn)行功能注釋，以有效的處理GO功能中的冗余，使分析結(jié)果更加可靠精確。應(yīng)用DAVID數(shù)據(jù)庫(Database for Annotation，Visualization and IntegratedDiscovery)對基因數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes)通路富集分析。以篩選在對燒傷后免疫功能紊亂中重要的生物學(xué)過程及通路。
　　

14、4 燒傷后第一天差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析
　　將燒傷后第一天所獲取的差異表達(dá)基因應(yīng)用STRING9.1數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein interaction network)。網(wǎng)絡(luò)分析及MCL網(wǎng)絡(luò)模塊分析采用生物圖表可視化工具Cytoscape軟件。并應(yīng)用BinGO2.44對網(wǎng)絡(luò)模塊進(jìn)行Gene Ontology功能富集分析。
　　結(jié)果：
　　1 統(tǒng)計分析
　　總共有2725個差

15、異表達(dá)基因被選出，在燒傷后2h組和燒傷后1d組差異表達(dá)基因以下調(diào)基因為主，而燒傷后3d和7d組則以上調(diào)基因為主，其中差異表達(dá)基因在小鼠燒傷后第1天變化最為顯著，共篩選出1825個差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因658個，下調(diào)基因1167個。在燒傷后2小時差異表達(dá)基因即發(fā)生明顯變化，同時聚類分析發(fā)現(xiàn)燒傷后基因在轉(zhuǎn)錄層面的變化并不是雜亂無章的。
　　2 GO功能富集分析結(jié)果
　　燒傷后2h組下調(diào)基因富集于是免疫系統(tǒng)過程(p-value

16、=4.27E-08)。在燒傷后1d組上調(diào)差異表達(dá)基因富集于應(yīng)對刺激反應(yīng)(46％)、代謝過程(60％)、免疫系統(tǒng)過程(16.6％)、細(xì)胞過程(75.5％)、生物調(diào)節(jié)(58.4％)及死亡過程(18.2％)等生物學(xué)過程中;而下調(diào)基因明顯富集于細(xì)胞過程(56.8％)、代謝過程(47.1％)、應(yīng)對刺激反應(yīng)(25.7％)、免疫系統(tǒng)過程(13.2％)等四個生物學(xué)過程中。在燒傷后第3d組差異表達(dá)基因富集于應(yīng)對刺激反應(yīng)(43.8％)及免疫系統(tǒng)過程(18.

17、1％)等生物學(xué)過程中。而燒傷后第7天上調(diào)基因富集于免疫系統(tǒng)過程(21.9％)、應(yīng)對刺激反應(yīng)(43.8％)及死亡(15.6％)等生物學(xué)過程中。
　　結(jié)論：
　　(1).燒傷后2小時小鼠免疫細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄水平即發(fā)生明顯變化，其中在燒傷后第1天變化最顯著，且這一變化并不是雜亂無章的，而是有一定規(guī)律可循的;
　　(2).燒傷早期免疫細(xì)胞生物調(diào)節(jié)及死亡（凋亡）等生物學(xué)功能增強;燒傷早期免疫細(xì)胞即存在免疫系統(tǒng)過程、代謝過程、應(yīng)對刺激反

18、應(yīng)、細(xì)胞過程等多種生物學(xué)功能的紊亂;其中免疫系統(tǒng)過程及刺激反應(yīng)等功能改變貫穿燒傷早期全程。
　　(3).Statl，Jun，Lck，Cd19，Sash3，Chek1，Cd79a等7個基因可能在燒傷早期多功能紊亂的發(fā)生中起著重要的作用，是燒傷后多功能紊亂潛在的早期診斷的生物靶標(biāo)。
　　(4).Lck，Myd88，Tlr2，Ccr2等4個免疫相關(guān)基因可能在燒傷后免疫系統(tǒng)功能變化過程中起著重要的作用，是燒傷免疫系統(tǒng)功能變化潛在的診