丙型肝炎病毒血清學(xué)分型方法的建立及初步臨床評(píng)價(jià).pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),目前全球約有1.8億人(占全球人口的3％)感染HCV,其中1.3億人為慢性HCV攜帶者。根據(jù)1992~1995年第二次病毒性肝炎血清學(xué)流行病調(diào)查結(jié)果顯示,我國人群抗-HCV的陽性率平均為3.2%,屬于中度流行。丙型肝炎易發(fā)展成慢性,約75%~85%急性肝炎可發(fā)展成慢性肝炎甚至肝硬化和肝癌。感染丙型肝炎病毒的病人在20~30年內(nèi)肝硬化發(fā)生率為10~25%,HCV引發(fā)的肝硬化病人10年后肝功能失代償發(fā)生率為30%,肝癌年

2、發(fā)生率為1%~3%,給我國的公共衛(wèi)生事業(yè)帶來極大的危害。
　　HCV為單股正鏈RNA病毒,屬黃病毒科,于1989年首次克隆成功,基因組全長約9.5kb,含有一個(gè)約9033個(gè)核苷酸構(gòu)成的開放讀碼框,編碼結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。結(jié)構(gòu)蛋白包括核心蛋白(C),包膜蛋白gp33(E1)、gp70(E2),非結(jié)構(gòu)蛋白有p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B等。由于RNA酶缺少校對(duì)功能,整個(gè)基因組呈現(xiàn)高度的變異性,目前HCV

3、至少分為6個(gè)基因型和80多種以上的亞型。在我國,主要的基因型為1b,其次為2a,還有其它少見型別。
　　根據(jù)我國《丙型肝炎防治指南》,慢性丙型肝炎標(biāo)準(zhǔn)治療方案是以聚乙二醇化干擾素α和利巴韋林為主的聯(lián)合治療。其中,基因型是聯(lián)合治療方案的一個(gè)重要基線預(yù)測指標(biāo),對(duì)臨床用藥的劑量和時(shí)間具有重要指導(dǎo)意義。目前常用的基因分型主要方法包括特異性引物擴(kuò)增后直接測序分析、限制性片段長度酶切多肽性(RFLP)分析、特異性探針PCR法及基因芯片法等,盡

4、管方法的特異性和靈敏度很高,但由于基因分型方法需要HCVRNA提取等過程,操作復(fù)雜,技術(shù)要求高,一般實(shí)驗(yàn)室難以開展,而且當(dāng)HCV-RNA陰性或由于保存不當(dāng)及處理過程中HCV-RNA遭到破壞時(shí),則不能進(jìn)行基因分型。為此,學(xué)者提出了HCV血清學(xué)分型,即在HCV基因型特異性抗原表位篩選的基礎(chǔ)上,采用血清學(xué)技術(shù),根據(jù)患者體內(nèi)型特異性抗體的存在情況,進(jìn)行血清學(xué)分型。
　　目前國際上商品化的HCV血清分型試劑主要有3種,分別是Murex HC

5、V1-6型、Chiron RIBA1-3型和日本HCV1、2血清分型試劑盒。其中美國Abbott公司的Murex HCV1-6型血清分型試劑是根據(jù)HCV-NS4區(qū)基因片段合成1-6型的型特異性多肽,采用抗原競爭免疫酶聯(lián)法,鑒定與基因型相對(duì)應(yīng)的不同血清型。由于受到不同國家地區(qū)及標(biāo)本選擇的影響,該試劑臨床評(píng)價(jià)結(jié)果不盡相同,分型率大致為60%~80%,與基因分型的符合率為90%~97%;Chiron公司研制生產(chǎn)的RIBA HCV血清分型試紙條

6、采用免疫膠體金技術(shù),根據(jù)NS4區(qū)型特異性表位多肽為主,Core區(qū)型特異性表位多肽為輔進(jìn)行血清學(xué)分型,其分型率能達(dá)到80%以上,特異性在90%~96%;另外日本國際試藥株式會(huì)社的HCVGr分型試劑盒是根據(jù)NS4區(qū)型特異性的抗原肽建立的血清分型試劑,僅能鑒定1、2型,分型率為89.6%,特異性為96.0%。但這些商品化的血清分型試劑在我國尚未注冊(cè),且價(jià)格昂貴,難于獲得,因此,本課題旨在研究建立針對(duì)我國主要流行基因型對(duì)應(yīng)血清型的分型方法,填補(bǔ)

7、國內(nèi)空白。
　　本課題根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,從HCV databases數(shù)據(jù)庫(http://hcv.lanl.gov/content/index)下載丙型肝炎病毒NS4區(qū)的氨基酸序列,通過Biosun生物信息學(xué)軟件對(duì)HCV-NS4區(qū)序列的抗原表位進(jìn)行預(yù)測分析,確定HCV-NS4區(qū)抗原表位主要位于1693~1708aa,C區(qū)型別特異性抗原表位位于67~81aa,并通過HCV databases數(shù)據(jù)庫在線進(jìn)行同源性比對(duì)分析,最后確定NS4區(qū)

8、I型氨基酸序列為AIIPDREVLYQEFDEM,Ⅱ型氨基酸序列為VVAPDKEVLYEAFDEM,C區(qū)I型氨基酸序列為KARRPEGRTWAQPGY,Ⅱ型氨基酸序列為KDRRTTGKSWGRPGY。根據(jù)確定的型別特異性氨基酸序列,采用大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子推斷出其對(duì)應(yīng)的核苷酸序列,通過重疊延伸PCR技術(shù)合成C-I、C-Ⅱ、NS4-I、NS4-Ⅱ、C+NS4-I型嵌合及C+NS4-Ⅱ型嵌合基因,酶切后插入PGEX-4T-2載體中,構(gòu)建出6株

9、高效表達(dá)質(zhì)粒,并采用GST瓊脂糖凝膠FF柱進(jìn)行純化,獲得了6個(gè)純度均為95%以上的抗原。
　　通過間接ELISA方法,采用50例抗-HCV抗體陽性的基因分型血清對(duì)6個(gè)抗原的抗原活性進(jìn)行初步檢測,結(jié)果顯示:獲得的3個(gè)I型抗原C-I、NS4-I及C+NS4-I嵌合與HCV-1b型血清的反應(yīng)性分別為25.71%、74.28%、88.57%,與HCV-2a型血清之間的交叉反應(yīng)性分別為20.00%、40.00%、66.67%,I型抗原與1b

10、血清之間的反應(yīng)性均高于與2a血清的反應(yīng)性,表現(xiàn)出I型抗原特有的型別特異性;獲得的3個(gè)II型抗原C-Ⅱ、NS4-Ⅱ、及C+NS4-Ⅱ嵌合與2a型血清的反應(yīng)性分別為33.33%、66.67%、73.33%,與1b型血清的交叉反應(yīng)性分別為11.42%、48.57%、28.57%,獲得的II型抗原與2a型血清的反應(yīng)性顯著高于1b型,表現(xiàn)出II型抗原特有的型別特異性。
　　為了消除型別特異性抗原與I、Ⅱ型血清之間交叉反應(yīng)性,本研究采用競爭免

11、疫酶聯(lián)法,并通過20組不同的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行HCV血清分型檢測方法的系統(tǒng)優(yōu)化,最終確定HCV血清分型檢測方法的工藝條件為:PH9.6碳酸鹽緩沖液作為包被液;20%山羊血清-0.01MPBSPH7.4為封閉液;LD5-HRP作為酶結(jié)合物(LD5是一種新的、具有更廣泛IgG結(jié)合特性的分子);確定競爭抗原的濃度為1.5μg/μl;競爭抗原稀釋液為山羊血清(5%)、酪蛋白(0.5%)-0.01MPBSPH7.4;4個(gè)NS4-I、C-I、NS4-Ⅱ及C-

12、Ⅱ型分片段抗原作為包被抗原,2個(gè)I、Ⅱ型嵌合抗原作為競爭抗原,設(shè)計(jì)了HCV血清分型的4孔檢測模式,并確定了結(jié)果判讀的計(jì)算方法。
　　采用128例HCV-1b血清和72例HCV-2a型血清對(duì)該技術(shù)進(jìn)行初步的臨床評(píng)價(jià),檢出I型102例,II型58例,I、II混合型2例,整體分型率為81.00%,與基因分型方法之間具有很好的一致性,其符合率分別為97.05%(kappa=0.959,p=0.024),接近國際報(bào)道。進(jìn)一步研究顯示:本血清

13、分型方法與117例非HCV感染的肝炎及其他肝病患者血清之間沒有明顯的交叉性,且分型效率與患者的年齡、抗體S/Co、HCV RNA滴度無關(guān)。
　　本研究的創(chuàng)新之處在于采用包含C區(qū)、NS4區(qū)兩個(gè)區(qū)段的型別特異性抗原進(jìn)行HCV血清分型,克服了抗體譜單一的問題,提高了樣本分型率;除此以外,本研究引入競爭免疫酶聯(lián)技術(shù)進(jìn)行HCV血清分型及工藝優(yōu)化的研究,相比間接酶聯(lián)免疫技術(shù),極大的提高了HCV血清分型的準(zhǔn)確率。
　　本研究建立的以競爭免