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文檔簡介
1、背景:帕金森病(Parkinson's disease,PD)是臨床上常見的神經(jīng)退行性疾病之一。PD的臨床表現(xiàn)主要為靜止性震顫、運動遲緩、步態(tài)異常和肌強直,PD的病因與發(fā)病機制尚無確切定論,主流研究認為這是一種與衰老、環(huán)境及遺傳因素密切相關的疾病。PINK1基因(PTEN-induced putative kinase1)是在2004年被克隆的PARK6致病基因,屬于常染色體隱性遺傳早發(fā)性帕金森綜合征的致病基因之一,該基因編碼產(chǎn)生一種由
2、581個氨基酸組成有激酶活性的線粒體蛋白,包括一個由34個氨基酸組成的線粒體定位結構域和一個由354個氨基酸組成的激酶結構域,此激酶結構域與Ca2+/鈣調蛋白家族的絲氨酸/蘇氨酸激酶高度同源。PINK1蛋自首先于2003年被證明它的激酶區(qū)域在體外實驗中有自磷酸化活性,PINK1蛋白能通過自身磷酸化后,調節(jié)其自身的激酶活性;PINK1蛋白也能參與體外磷酸化,如磷酸化組蛋白H1或酪蛋白。有研究發(fā)現(xiàn)PINK1基因的致病突變影響了PINK1蛋白
3、的磷酸化。但未有PINK1蛋白自身磷酸化位點體外實驗的鑒定研究報道,及PINK1蛋白的自身磷酸化修飾位點改變對其體外激酶活性影響研究報道。在前期工作中我們發(fā)現(xiàn)了兩種PINK1基因新的純合致病突變(T313M,R492X),兩者均位于激酶結構域中,從而導致其激酶功能改變,也可能對穩(wěn)定PINK1蛋白的結構起重要作用,這兩種致病突變的致病機理仍有待探討。
目的:探討PINK1蛋白自磷酸化修飾功能及磷酸化底物功能參與帕金森病致病的機制
4、
方法:⑴應用谷胱甘肽親和層析法純化法、體外磷酸化和質譜技術鑒定PINK1蛋白的自身磷酸化修飾位點;⑵應用體外磷酸化和放射自顯影技術明確PINK1蛋白的自磷酸化修飾位點;⑶應用體外磷酸化和放射自顯影技術檢測PINK1的自磷酸化修飾位點突變、T313M、R492X突變對PINK1蛋白的激酶活性的影響;⑷應用脂質體過表達、細胞免疫熒光化學染色的方法檢測自磷酸化修飾位點對PINK1在真核細胞中的亞細胞定位的影響;⑸應用脂質體過表達、
5、chase-time技術研究自磷酸化位點突變對PINK1自身降解的影響;⑹應用脂質體過表達、細胞免疫熒光化學染色的方法檢測PINK1自磷酸化修飾位點突變、T313M、R492X突變PINK1對Parkin亞細胞定位的影響。
結果:①質譜結果顯示一個PINK1蛋白可能的自身磷酸化位點:PINK1第465位絲氨酸殘基-Ser465,通過生物信息比對可知,該氨基酸殘基在絕大多數(shù)種屬中高度保守。②放射自顯影結果示:在體外磷酸化條件下,
6、野生型PINK1蛋白能夠被自身磷酸化,而S465A突變型PINK1蛋白自身磷酸化水平較野生型降低,兩者的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。③放射自顯影結果示:在體外磷酸化條件下,野生型PINK1蛋白能夠磷酸化酪蛋白(casein),而T313M、R492X、S465A突變型PINK1蛋白磷酸化底物水平較野生型降低,三種突變型PINK1蛋白分別與野生型PINK1蛋白進行兩兩比較的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。④HEK293細胞免
7、疫熒光化學染色結果顯示:野生型PINK1蛋白分布于細胞胞質,呈典型的點狀分布的線粒體定位;而S465A、S465D突變型PINK1蛋白的亞細胞定位沒有明顯變化,仍呈胞漿中線粒體定位。⑤Chase-time實驗結果顯示:S465A、S465D突變型PINK1蛋白降解的半衰期較野生型延長,降解減慢。⑥HEK293細胞免疫熒光化學染色結果顯示:野生型PINK1蛋白和S465D突變型PINK1蛋白均促進Parkin蛋白轉移到聚集的線粒體上,S4
8、65A、T313M、R492X突變型PINK1蛋白促進此過程的效率明顯下降。
結論:⑴PINK1蛋白第465位絲氨酸殘基Ser465為其體外自磷酸化的位點之一;⑵PINK1蛋白第465位絲氨酸殘基Ser465突變、PINK1致病突變T313M、R492X均能引起PINK1體外磷酸化激酶活性降低;⑶PINK1蛋白第465位絲氨酸殘基Ser465對PINK1蛋白真核細胞內亞細胞定位無影響;⑷PINK1蛋白第465位絲氨酸殘基Ser
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