富氫溶液對(duì)雄性小鼠生精細(xì)胞的輻射防護(hù)效應(yīng)與機(jī)制.pdf

1、背景：
　　 以往的研究已經(jīng)表明，雄性生殖系統(tǒng)由干細(xì)胞增殖分化為精子的過(guò)程對(duì)電離輻射極為敏感，0.1Gy即可造成精原細(xì)胞的損傷。隨著核技術(shù)廣泛應(yīng)用于能源領(lǐng)域、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域和工業(yè)領(lǐng)域，職業(yè)性工人、病人和公眾暴露于電離輻射的危險(xiǎn)性倍受關(guān)注。雄性生殖系統(tǒng)常因盆腔或下腹部放射治療，或發(fā)生意外事故而受到電離輻射的影響，受照劑量較小時(shí)可出現(xiàn)暫時(shí)性生育能力下降，受照劑量較大時(shí)可導(dǎo)致永久性不育。因此，對(duì)雄性生殖系統(tǒng)的輻射損傷防護(hù)研究具有十分重要的社

2、會(huì)需求。
　　 在輻射損傷醫(yī)學(xué)防護(hù)研究領(lǐng)域，大部分防治措施主要針對(duì)的是電離輻射的間接作用。電離輻射對(duì)機(jī)體的危害方式可分為直接作用和間接作用。直接作用是電離輻射將其能量直接傳遞給生物大分子，使其發(fā)生電離而破壞，電離過(guò)程只需10-14秒就可完成，只能用物理屏蔽的方法來(lái)減輕電離輻射的直接作用。間接作用是電離輻射將其能量首先傳遞給生物大分子周圍的水分子等介質(zhì)，產(chǎn)生多種對(duì)機(jī)體有害的自由基，例如，羥自由基、水合電子和氫自由基等，這些自由基再

3、作用于生物大分子使后者破壞，導(dǎo)致機(jī)體輻射損傷。雖然以往對(duì)雄性生殖系統(tǒng)輻射損傷醫(yī)學(xué)防護(hù)開(kāi)展過(guò)不少研究，至今除了物理屏蔽外，未找到一種較理想的防護(hù)手段。本教研室近年來(lái)發(fā)現(xiàn)氫氣具有良好的輻射防護(hù)作用，可以保護(hù)培養(yǎng)的細(xì)胞、小鼠造血系統(tǒng)、小腸和心臟，降低死亡率。Terasaki等證明氫氣可以防治小鼠的放射性肺炎。但是，關(guān)于氫氣對(duì)雄性生殖系統(tǒng)是否同樣具有輻射保護(hù)作用，未見(jiàn)研究報(bào)道。正是由于睪丸對(duì)電離輻射敏感以及對(duì)男性生育的重要性，本課題選擇雄性小鼠

4、為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究氫氣對(duì)雄性生精細(xì)胞的輻射防護(hù)效應(yīng)及其作用機(jī)制。
　　 研究?jī)?nèi)容：
　　 1.富氫溶液對(duì)雄性小鼠生精細(xì)胞輻射損傷的防護(hù)效應(yīng)
　　 1.1.富氫溶液對(duì)受照小鼠精原細(xì)胞早期凋亡的防護(hù)作用
　　 1.1.1.富氫溶液對(duì)受照小鼠生精細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響
　　 1.1.2.富氫溶液對(duì)受照小鼠生精細(xì)胞DNA的影響
　　 1.2.富氫溶液對(duì)受照小鼠精子發(fā)生的防護(hù)作用
　　 1.2.1.

5、富氫溶液對(duì)受照小鼠每日精子生成量的影響
　　 1.2.2.富氫溶液對(duì)受照小鼠精子質(zhì)量的影響
　　 1.3.富氫溶液對(duì)輻照后小鼠睪丸組織的防護(hù)作用
　　 1.3.1.富氫溶液對(duì)受照小鼠睪丸臟器指數(shù)的影響
　　 1.3.2.富氫溶液對(duì)受照小鼠睪丸組織病理改變的影響
　　 1.3.3.富氫溶液對(duì)受照小鼠睪丸小管分化指數(shù)的影響
　　 2.富氫溶液對(duì)雄性小鼠生精細(xì)胞輻射防護(hù)效應(yīng)的作用機(jī)制
　　

6、 2.1.富氫溶液對(duì)羥自由基的清除作用
　　 2.1.1.富氫溶液對(duì)芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基的清除作用
　　 2.1.2.富氫溶液對(duì)輻射分解水產(chǎn)生的羥自由基的清除作用
　　 2.1.3.富氫溶液對(duì)受照小鼠睪丸內(nèi)羥自由基的清除作用
　　 2.2.富氫溶液對(duì)受照小鼠睪丸內(nèi)氧化損傷的影響
　　 2.2.1.富氫溶液對(duì)受照小鼠睪丸內(nèi)內(nèi)源性抗氧劑的影響
　　 2.2.2.富氫溶液對(duì)受照小鼠睪丸內(nèi)氧化

7、損傷產(chǎn)物的影響
　　 2.2.3.腹腔注射富氫溶液后睪丸內(nèi)氫氣濃度的變化
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.將高純的氫氣緩緩灌入生理鹽水/磷酸鹽緩沖液中，氣體與液體的體積比為0.5:1，在0.4個(gè)大氣壓下2小時(shí)過(guò)飽和于生理鹽水中。緩緩減壓，再經(jīng)過(guò)半小時(shí)，加壓艙的氣壓降至常壓時(shí)，將生理鹽水袋取出，存放至4℃冰箱中。
　　 2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照第二軍醫(yī)大學(xué)的有關(guān)規(guī)定進(jìn)行。小鼠被隨機(jī)分為正常組、給氫組、照射組和照射給氫組

8、，在塑料模具中腹部向源，接受全身照射。照射劑量5Gy，劑量率2Gy/分鐘。
　　 3.照射后12小時(shí)，使用HE染色法和TUNEL法評(píng)價(jià)生精細(xì)胞的凋亡情況。HE染色中，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞核呈藍(lán)黑色，胞漿呈淡紅色。TUNEL染色中，光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞核呈棕色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)合形態(tài)特征，可確立凋亡細(xì)胞。
　　 4.照射后29天，檢測(cè)睪丸的重量、精子頭計(jì)數(shù)和睪丸的組織學(xué)變化。29天時(shí)間剛好是精原細(xì)胞分化發(fā)育為精子的時(shí)間。照后29

9、天檢測(cè)，反應(yīng)了29天前照射時(shí)精原細(xì)胞受損的情況。
　　 5.照射后35天，檢測(cè)睪丸生精小管分化指數(shù)，反應(yīng)了35天前照射時(shí)生精干細(xì)胞受損的情況。照射后56天，檢測(cè)每日精子生成量和精子質(zhì)量，反應(yīng)了56天前照射時(shí)生精干細(xì)胞受損的情況。
　　 6.使用5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物做為自旋捕獲劑來(lái)捕獲由芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基。使用0.1mM的過(guò)氧化氫和0.03mM的亞鐵離子在35mM的DMPO體系中發(fā)生羥自由基，迅速將該

10、體系置于ESR中檢測(cè)，ESR掃描30秒，疊加6次。
　　 7.使用羥自由基熒光素做為捕獲劑來(lái)捕獲由輻射分解水產(chǎn)生的羥自由基。繪制出HPF熒光強(qiáng)度和電離輻射劑量之間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用490nm激發(fā)光激發(fā)HPF，讀取熒光強(qiáng)度。比較不同濃度富氫溶液對(duì)羥自由基的清除效果。
　　 8.羥自由基熒光素在照射前20分子給予小鼠睪丸內(nèi)注射，照射后迅速取下睪丸，制成冰凍切片觀察。使用490nm激發(fā)光激發(fā)HPF，讀取熒光強(qiáng)度，研究富氫溶液

11、對(duì)小鼠睪丸內(nèi)羥自由基的清除效果。
　　 9.使用商業(yè)化的試劑盒檢測(cè)睪丸的酶類內(nèi)源性抗氧化劑(超氧化物歧化酶)、非酶類內(nèi)源性抗氧化劑(谷光甘肽)和氧化損傷標(biāo)志產(chǎn)物(丙二醛、蛋白羰基和8羥基脫氧鳥(niǎo)苷)。
　　 10.使用微電極插入睪丸內(nèi)讀取數(shù)值。無(wú)菌條件下，在小鼠下腹部橫向切開(kāi)一個(gè)0.5cm的切口，解刨出雙側(cè)睪丸。在不同時(shí)間段，將氫電極緩緩刺入小鼠睪丸內(nèi)300μm，檢測(cè)氫氣濃度的變化。再參照已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)確定睪丸內(nèi)的氫氣濃

12、度。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.富氫溶液對(duì)雄性小鼠生精細(xì)胞輻射損傷的防護(hù)效應(yīng)
　　 1.1.富氫溶液保護(hù)受照小鼠精原細(xì)胞
　　 1.1.1.C57BL/6小鼠5Gy全身照射后12小時(shí)取雙側(cè)睪丸進(jìn)行HE染色，不正常的精原細(xì)胞主要表現(xiàn)為核固縮，給氫組的凋亡發(fā)生率明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，表明氫氣可以緩解輻射誘導(dǎo)的生精細(xì)胞的凋亡。
　　 1.1.2.C57BL/6小鼠5Gy全身照射后12小時(shí)取雙

13、側(cè)睪丸進(jìn)行TUNEL染色，TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞只存在于精原細(xì)胞和精母細(xì)胞中，給氫組的TUNEI陽(yáng)性率明顯低于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，表明氫氣可以緩解輻射誘導(dǎo)的生精細(xì)胞的凋亡。
　　 1.2.富氫溶液保護(hù)受照小鼠精子發(fā)生
　　 1.2.1.照后29天檢測(cè)睪丸精子頭計(jì)數(shù)，小鼠受到0.5Gy，1.0Gy，2.0Gy和4Gy輻射后，在給氫組精子頭計(jì)數(shù)分別為11.8×107/g，7.0×107/g，4.1×107/g

14、和2.9×107/g，這分別是對(duì)照組的1.4倍，1.5倍，1.6倍和1.7倍(P<0.05)，是正常組的77.7％，45.9％，27.1％和18.8％。照后56天檢測(cè)睪丸精子頭計(jì)數(shù)，計(jì)算每日精子生成量。小鼠受到5Gy輻射后，給氫氣組和WR-2721組小鼠的每日精子生成量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，WR-2721組小鼠的每日精子生成量與給氫氣組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 1.2.2.照后56天檢測(cè)附睪精子質(zhì)量，包

15、括精子計(jì)數(shù)，畸形率計(jì)算和活動(dòng)度計(jì)算。小鼠受到5Gy輻射后，給氫氣組和WR-2721組小鼠的精子計(jì)數(shù)(P<0.05)，畸形率(P<0.05)和活動(dòng)度(P<0.05，P<0.01)顯著高于對(duì)照組，WR-2721組小鼠的精子計(jì)數(shù)(P>0.05)，畸形率(P>0.05)與給氫氣組無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，WR-2721組小鼠的精子活動(dòng)度顯著高于給氫氣組(P<0.05)。
　　 1.3.富氫溶液保護(hù)輻照后小鼠睪丸組織
　　 1.3.1.照

16、后29天檢測(cè)附小鼠睪丸臟器指數(shù)，稱量小鼠體重和雙側(cè)睪丸重量。小鼠受到0.5Gy，1Gy，2Gy和4Gy輻射后，給氫氣組小鼠的睪丸臟器指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。
　　 1.3.2.腹腔注射富氫溶液顯著改善小鼠睪丸的組織學(xué)損傷，照射后29天觀察，精子和其它各級(jí)生精細(xì)胞在一些生精小管中有不同程度的缺失，有些小管中出現(xiàn)了較大的空腔，所有這些改變均被氫氣緩解。
　　 1.3.3.5Gy照射35天后檢測(cè)受照小鼠睪丸小管分化

17、指數(shù)，給氫氣組和WR-2721組小鼠的睪丸小管分化指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)，WR-2721組小鼠的睪丸小管分化指數(shù)顯著高于給氫氣組(P<0.05)。
　　 2.富氫溶液對(duì)雄性小鼠生精細(xì)胞輻射防護(hù)效應(yīng)的作用機(jī)制
　　 2.1.富氫溶液對(duì)羥自由基的清除作用
　　 2.1.1.在芬頓體系中加入不同濃度富H2溶液，應(yīng)用5，5-dimethyl-1-pyrrolineN-oxide(DMPO)捕獲由

18、芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的·OH。在飽和H2濃度時(shí)，反應(yīng)體系中約有80％左右的羥自由基被清除(P<0.05)。
　　 2.1.2.羥自由基熒光素?zé)晒鈴?qiáng)度和電離輻射劑量之間呈明顯的線性關(guān)系，R2=0.991。在5Gy的劑量下，氫氣抑制了88.7％的熒光信號(hào)(P<0.01)。
　　 2.1.3.腹腔注射富氫溶液顯著降低小鼠睪丸內(nèi)的羥自由基水平(P<0.01)，照射前20分鐘睪丸內(nèi)注射HPF，照射前5分鐘腹腔注射富氫溶液。羥自由基熒光顯著

19、的被氫氣抑制，但當(dāng)照射后加氫氣時(shí)，這種抑制不明顯。
　　 2.2.富氫溶液對(duì)受照小鼠睪丸內(nèi)氧化損傷的影響
　　 2.2.1.超氧化物歧化酶SOD是細(xì)胞內(nèi)重要的酶類內(nèi)源性抗氧化劑，還原型谷胱甘肽GSH是細(xì)胞內(nèi)重要的非酶類內(nèi)源性抗氧化劑，電離輻射通過(guò)影響SOD和GSH的結(jié)構(gòu)來(lái)使其失活，腹腔注射富氫溶液顯著保存小鼠睪丸內(nèi)SOD的活性和GSH的濃度(P<0.05)，提示氫氣可以保存內(nèi)源性抗氧化劑。
　　 2.2.2.電離

20、輻射與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA、蛋白羰基和8-OHdG等氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)照后這些氧化損傷標(biāo)志產(chǎn)物的濃度，可以評(píng)價(jià)照后睪丸氧化損傷程度。腹腔注射富氫溶液顯著降低小鼠睪丸內(nèi)MDA、蛋白羰基和8-OHdG的濃度(P<0.05)，提示氫氣可以緩解內(nèi)氧化損傷。
　　 2.2.3.腹腔注射富氫溶液顯著提高小鼠睪丸內(nèi)的氫氣濃度，注射5分鐘后氫氣的濃度在小鼠睪丸內(nèi)達(dá)到峰值，為正常水平的2.8倍(P<0.05)，注射

21、10后為正常水平的1.8倍(P<0.05)，注射15分鐘后恢復(fù)正常值(P>0.05)。
　　 討論分析：
　　 我們從生精細(xì)胞、精子數(shù)量質(zhì)量和睪丸組織學(xué)三方面著手研究氫氣的輻射防護(hù)效應(yīng)。結(jié)果顯示，氫氣的輻射防護(hù)效應(yīng)表現(xiàn)為氫氣對(duì)照后生精細(xì)胞早期凋亡的抑制，從而在輻照中保存生精細(xì)胞活力。凋亡是照后生精細(xì)胞缺失的主要方式，我們通過(guò)經(jīng)典的HE組織染色和對(duì)凋亡DNA特異的TUNEL染色兩種方法，在照后12小時(shí)的凋亡發(fā)生高峰時(shí)間檢測(cè)

22、睪丸生精細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)氫氣顯著抑制精原細(xì)胞和精母細(xì)胞的凋亡。通過(guò)睪丸精子頭計(jì)數(shù)和附睪精子質(zhì)量的檢測(cè)也證明氫氣可以在電離輻射中有效的保護(hù)精子發(fā)生這一過(guò)程。針對(duì)睪丸組織的檢測(cè)中，氫氣可以有效提高照后小鼠睪丸臟器指數(shù)，睪丸生精小管直徑、睪丸組織學(xué)評(píng)分和睪丸生精小管分化指數(shù)等。
　　 本研究首次證實(shí)了氫氣的輻射防護(hù)作用與其在活體內(nèi)清除羥自由基有關(guān)，氫氣可以做為預(yù)防性的抗氧化劑應(yīng)用于睪丸輻射損傷。在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，不同濃度的富氫溶液顯著抑制由芬

23、頓反應(yīng)產(chǎn)生的·DMPO-OH自由基信號(hào)。在體內(nèi)與體外，HPF已經(jīng)成功的應(yīng)用于缺血再灌注產(chǎn)生活性氧的檢測(cè)。我們繪制了HPF熒光強(qiáng)度和電離輻射見(jiàn)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)二者成比例。因此我們認(rèn)為HPF可以有效的檢測(cè)水輻射分解產(chǎn)生的羥自由基。在另外一個(gè)無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，不同濃度的富氫溶液顯著抑制由水輻射分解產(chǎn)生的羥自由基熒光。腹腔注射富氫溶液顯著提高小鼠睪丸內(nèi)的氫氣濃度，注射后5分鐘氫氣濃度達(dá)到峰值，所以我們?cè)谡丈淝?分鐘給予小鼠氫氣。氫氣可以顯著抑制輻射誘導(dǎo)