iNOS基因與原發(fā)性高血壓的關(guān)聯(lián)及功能鑒定.pdf

1、本文為了探討iNOS基因在EH發(fā)生中的作用，聯(lián)合采用了基因掃描的連鎖分析和候選基因的關(guān)聯(lián)研究?jī)煞N研究策略，在高血壓高發(fā)區(qū)選擇高血壓家系通過(guò)連鎖分析確定iNOS基因是否是該人群高血壓的易感基因，并選擇iNOS啟動(dòng)子區(qū)rSNP-1026C/A位點(diǎn)與EH進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。在此基礎(chǔ)上，利用軟件預(yù)測(cè)、報(bào)告基因活性檢測(cè)和EMSA等方法分析iNOS基因的啟動(dòng)子功能，對(duì)其中rSNP-1026C/A位點(diǎn)進(jìn)行了功能鑒定，以明確iNOS基因在EH致病機(jī)制中的作用

2、。 研究材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)材料： 1、人類(lèi)肝癌Bel細(xì)胞。 2、STR基因分型相關(guān)試劑。 3、Real-time PCR．相關(guān)試劑。 4、基因克隆及螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)相關(guān)分子生物學(xué)試劑。 5、電泳泳動(dòng)遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)相關(guān)試劑。 6、Western印跡雜交相關(guān)試劑 二、實(shí)驗(yàn)方法： 1、從遼寧省彰武縣高血壓高發(fā)區(qū)漢族人群，收

3、集67個(gè)原發(fā)性高血壓家系，在高血壓熱點(diǎn)候選區(qū)域17qcen-17q11.1和17q21-17q22區(qū)域內(nèi)分別選擇D17S1878位點(diǎn)和D17S932位點(diǎn)。在ABI PRISMmm<'TM> 310型遺傳分析儀上用GeneScanAnalysis2.02軟件進(jìn)行基因型自動(dòng)分析，應(yīng)用受累同胞對(duì)方法進(jìn)行連鎖分析。 2、在該研究人群中隨機(jī)選取高血壓患者和正常對(duì)照共計(jì)610人進(jìn)行病例一對(duì)照研究。選擇iNOS-1026C/A SNP位點(diǎn)，應(yīng)

4、用Real-time PCR儀進(jìn)行基因分型，統(tǒng)計(jì)分析其與EH的關(guān)聯(lián)性；并按年齡分層分析其與EH的關(guān)聯(lián)性。應(yīng)用非條件Logistic多因素分析，排除其它危險(xiǎn)因素的干擾。 3、PCR克隆構(gòu)建iNOS啟動(dòng)子區(qū)的-1026C與-1026A兩種基因型的螢光素酶報(bào)告基因表達(dá)載體，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人肝癌Bel細(xì)胞，應(yīng)用螢光素酶試劑盒檢測(cè)螢光素酶活性，鑒定不同基因型的iNOS啟動(dòng)子的活性。 4、電泳泳動(dòng)遷移分析(EMSA)鑒定iNOS啟動(dòng)子

5、區(qū)順式作用元件，合成-1026C/A位點(diǎn)的寡核苷酸，經(jīng)復(fù)性和末端標(biāo)記后與Bel細(xì)胞核提取物結(jié)合，YY1特異性抗體競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)用于判斷特異性結(jié)合帶；染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)在體內(nèi)條件下鑒定iNOS啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件。 5、利用不同濃度脂多糖(LPS)刺激細(xì)胞的YY1信號(hào)通路，應(yīng)用Western印跡雜交檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子YY1的蛋白表達(dá)量。 研究結(jié)果： 1、家系研究資料表明，年齡較大、飲酒、性格急躁者易患高血壓，BMI、

6、甘油三酯等也是高血壓的危險(xiǎn)因素；病例對(duì)照研究資料表明，年齡、甘油三酯、BMI是該人群高血壓發(fā)生的弱危險(xiǎn)因素。 2、受累同胞對(duì)連鎖分析結(jié)果顯示，D17S1878和D17S932的t分別為1.88和3.95，P<0.05，說(shuō)明受累同胞對(duì)隨機(jī)共享這兩個(gè)位點(diǎn)的相同等位基因的比例高于預(yù)期的25％。 3、病例對(duì)照的關(guān)聯(lián)分析表明，iNOS-1026C/A位點(diǎn)的基因型頻率在高血壓組和正常對(duì)照組之間分布存存統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(X<'2>=7

7、2.45，P=0.00)；按年齡分層分析顯示，40～、50～、60～年齡亞組中，iNOS-1026C/A位點(diǎn)與EH顯著關(guān)聯(lián)。經(jīng)過(guò)非條件Logistic多因素分析，基因型AA相對(duì)于基因型CA+CC的OR值為0.129，95％CI為0.053～0.318，是EH的強(qiáng)保護(hù)因子。 4、不同基因型載體螢光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示pGL3-1026A和pGL3-1026C的活性均高于pGL3-basic，并且pGL3-026A的活性高于pGL3

8、-1026C的活性。 5、對(duì)iNOS啟動(dòng)子區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，-1026C/A位點(diǎn)改變了轉(zhuǎn)錄因子YY1的結(jié)合位點(diǎn)，EMSA的結(jié)果發(fā)現(xiàn)-1026C可以與轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合。ChIP的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)在活細(xì)胞內(nèi)這一結(jié)合作用的存在。 6、螢光素酶分析和EMSA的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS可以增強(qiáng)iNOS的YY1反應(yīng)元件與轉(zhuǎn)錄因子YY1的結(jié)合能力。Western印跡雜交結(jié)果顯示，LPS可以使YY1蛋白的表達(dá)量增加。 研究結(jié)論：

9、1、本研究的高血壓高發(fā)人群中，17qcen-17q 11.1和17q 21-17q 22區(qū)域內(nèi)的STR位點(diǎn)D17S1878和D17S932附近存在EH易感基因。 2、iNOS-1026C/A位點(diǎn)與EH存在關(guān)聯(lián)，基因型AA可能存EH發(fā)生中起保護(hù)作用。 3、iNOS-1026C/A位點(diǎn)是功能性SNP位點(diǎn)，通過(guò)改變與轉(zhuǎn)錄因子YY1的結(jié)合發(fā)揮功能性位點(diǎn)的作用。 4、LPS通過(guò)提高轉(zhuǎn)錄因子YY1的蛋白表達(dá)量，增強(qiáng)YY1結(jié)合