腸三葉因子對腸上皮細(xì)胞MTX損傷的預(yù)防作用及其機(jī)制.pdf

1、第一部分MTX對腸上皮細(xì)胞損傷作用的研究 目的：1.建立MTX致腸粘膜上皮損傷的細(xì)胞研究模型,確定MTx的最適濃度和作用時(shí)間;2.明確caspase-3在MTX誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡中的作用. 方法：腸上皮細(xì)胞株(intestinal epithelial cell-6,IEC-6)以10﹪FBS-DMEM培養(yǎng)液,置于37℃,5﹪CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng).根據(jù)參考文獻(xiàn)和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,MTX終濃度分別為0.05μg/ml、0.5gg

2、/ml、51μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的培養(yǎng)液組為實(shí)驗(yàn)組,對照組為不加MTX的培養(yǎng)液.1.CCK-8法檢測MTX對IEC-6細(xì)胞的抑制率;2.凋亡細(xì)胞的TUNEL的流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞;3.分光光度法檢測Caspase-3的活性. 結(jié)果：1.實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長抑制率明顯高于對照組,且隨MTX藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長而增加.2.0.05μg/ml、0.5μg/ml和5μg/ml MTX作用24h,細(xì)胞凋亡率增

3、加.與空白組相比,差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01).表明MTX可誘導(dǎo)IEC-6發(fā)生凋亡.3.0.05μg/ml、0.51μg/ml和5μg/ml MTX作用24h,caspase-3活性增加,三組caspase-3的活性分別是空白組的1.97、3.07和5.01倍.與空白組相比,各濃度藥物組caspase-3活性明顯增強(qiáng)(P<0.01),且呈濃度依賴性(組內(nèi)兩兩比較,均P<0.01).提示MTX作用IEC-6后,可顯著誘導(dǎo)IEC-

4、6細(xì)胞Caspase-3活性的增加.4.MTX濃度為0.5μg/ml、作用24h,細(xì)胞增殖抑制率約為43.02﹪±2.64﹪,凋亡率為54.79﹪±3.86﹪,caspase-3活性為空白組的3.07倍,作為第二部分實(shí)驗(yàn)的初始培養(yǎng)條件. 結(jié)論：1.MTX對IEC-6細(xì)胞株的增殖具有明顯的抑制作用,其抑制率與藥物濃度及藥物作用時(shí)間有關(guān).2.MTX通過誘導(dǎo)Caspase-3活化,導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡. 第二部分 ITF對M

5、TX所致腸粘膜細(xì)胞損傷防護(hù)機(jī)制的研究 目的：探討重組人腸三葉因子(recombination human intestinal trefoil factor,rhlTF,簡稱ITF)防護(hù)MTX所致腸粘膜細(xì)胞損傷的機(jī)制. 方法：以不同濃度ITF預(yù)處理24h后、再予0.5μg/ml MTX培養(yǎng)24h為實(shí)驗(yàn)組,以不加ITF而先予DMEM培養(yǎng)24h后、再予0.5μg/ml MTX培養(yǎng)24h和1.0mg/mllTF預(yù)處理后不使用M

6、TX分別為MTX對照組*HITF對照組,DlVIEM培養(yǎng)液組為空白組;1.ITF對IEC-6細(xì)胞增殖的影響:CCK-8法檢測;2.ITF對IEC-6細(xì)胞凋亡的影響:分光光度法檢測Caspase-3活性;3.ITF對IEC.6細(xì)胞遷移的影響:(1)改良的Boyden趨化小室法觀察細(xì)胞遷移;(2)明膠酶譜法檢測MMP2、MMP9活性;(3)RT-PCR法檢測基因E-cadherin表達(dá)變化. 結(jié)果：1.與空白組比,ITF對照組增殖率

7、稍有增加,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);ITF對照組caspase-3活性無明顯變化,ITF對照組穿膜細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01).2.與MTX對照組相比,ITF(1μg/ml～1.0mg/ml)實(shí)驗(yàn)組的IEC-6細(xì)胞的增殖率略有增加,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).3.與MTX對照組相比,0.1mg/mlITF實(shí)驗(yàn)組caspase-3活性下降(P<0.05),1.0mg/mlITF實(shí)驗(yàn)組caspase-3明顯下降(P<0.01)4

8、.與MTX對照組相比,ITF實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)增加(P<0.01),且1.0mg/mlITF組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于0.1mg/ml ITF實(shí)驗(yàn)組(P<0.01).5.與MTX對照組相比,ITF實(shí)驗(yàn)組MMP2、MMP9活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05).6.與MTX對照組相比,ITF(0.1mg/ml,1.0mg/ml)實(shí)驗(yàn)組E-cadherin mRNA表達(dá)量下降(P<0.05). 結(jié)論： 1.一定濃度的ITF對正常情況