赭曲霉毒素A對人胃黏膜上皮細胞(GES-1)和食管黏膜上皮細胞(Het-1A)DNA和染色體損傷作用的研究.pdf

1、目的：赭曲霉毒素A(OTA)是一種由純綠青霉（Penicillium verrucosum）、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)產(chǎn)生的在自然界中廣泛存在的真菌毒素。研究發(fā)現(xiàn)，小麥、玉米等糧食作物及其制品中OTA的污染情況相當普遍，當人和動物食用了被OTA污染的食物和飼料后，其血液、膽汁、尿液、乳汁中均可檢測到OTA的殘留物。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)OTA具有肝毒性、腎毒性、免疫毒性、神

2、經(jīng)毒性、致畸性、致突變性和致癌性等生物學效應。1993年OTA被國際癌癥研究中心列為“人類可能的致癌物”。
　　 2006年，實驗室對河北省中南部太行山區(qū)食管癌和胃癌高發(fā)區(qū)磁縣和贊皇縣居民糧食中OTA的污染狀況進行調(diào)查，結果發(fā)現(xiàn)兩地居民食用的小麥中OTA的檢出率為37.70％，其中OTA的最低含量為0.23μg/kg，最高含量達到14.25μg/kg，均明顯高于世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織聯(lián)合專家委員會(Joint FAO/WHO E

3、xpert Committee on Food Additives，JECFA)暫定的每周容許攝入量100ng/kg。鑒于OTA在食管癌、胃癌高發(fā)區(qū)糧食中的高污染情況以及人類的可能致癌性，探討OTA與當?shù)鼐用袷彻馨⑽赴┑陌l(fā)生的可能關系對胃癌防治具有非常重要的意義。
　　 DNA是機體生命活動最重要的遺傳物質(zhì)，染色體是遺傳物質(zhì)的載體，是由一條雙螺旋結構的DNA鏈與組蛋白結合而成的。DNA是致癌性物質(zhì)攻擊的主要靶分子，致癌性物質(zhì)能

4、夠直接或間接損傷DNA，從而使DNA在復制過程中發(fā)生DNA核苷酸序列永久性的改變，進而導致染色體發(fā)生斷裂，從而使腫瘤更加易于形成。但是目前有關OTA對人胃黏膜上皮細胞和食管黏膜上皮細胞DNA和染色體影響的研究在國內(nèi)外均未見報道。
　　 本研究擬用永生化人正常胃黏膜上皮細胞(GES-1)和人正常食管黏膜上皮細胞(Het-1A)作為研究對象，應用染色體核型分析技術和單細胞凝膠電泳實驗從細胞水平上檢測OTA對GES-1細胞和Het-1

5、A細胞染色體及DNA的損傷情況。以期揭示OTA暴露與人胃黏膜和食管黏膜的損傷乃至胃癌、食管癌發(fā)生的關系，這對于提高我國農(nóng)村居民，特別是胃癌、食管癌高發(fā)區(qū)居民食品的衛(wèi)生安全具有重要意義。
　　 方法：
　　 1、細胞培養(yǎng)及處理
　　 正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1、人食管黏膜上皮細胞株Het-1A細胞株培養(yǎng)，傳代24h后選擇對數(shù)生長期的細胞，隨機分為溶劑對照組和OTA處理組。OTA處理組分別予以終濃度為2.5μm

6、ol/L、5μmol/L、10μmol/L及20μmol/L處理24h；10μmol/LOTA分別作用6h、12h、24h和36h，于實驗處理相應的時間后收集細胞進行相關指標檢測。
　　 2、單細胞凝膠電泳實驗檢測DNA的損傷情況
　　 2.1采用單細胞凝膠電泳實驗檢測OTA(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)作用GES-1細胞和Het-1A細胞24h后Tail DNA％、Tail

7、Length、Olive Tail Moment的變化情況。
　　 2.2采用單細胞凝膠電泳實驗檢測10μmol/L OTA分別處理GES-1細胞和Het-1A細胞6h、12h、24h、36h后Tail DNA％、Tail Length、Olive Tail Moment的變化情況。
　　 3染色體核型分析實驗觀察細胞染色體畸變情況3.1利用染色體核型分析觀察OTA作用于GES-1細胞(2.5μmol/L、5μmol/L

8、、10μmol/L)以及Het-1A細胞(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)24h后染色體發(fā)生的變化情況。
　　 3.2利用染色體核型分析觀察10μmol/L OTA分別處理GES-1細胞和Het-1A細胞6h、12h、24h、36h后細胞染色體結構和數(shù)目的變化情況。
　　 結果：
　　 1、OTA對GES-1細胞DNA的損傷作用
　　 1.1不同濃度OTA對GES-

9、1細胞DNA的損傷作用：單細胞凝膠電泳實驗結果顯示，不同濃度OTA處理GES-1細胞24h后，各處理組的彗星率均顯著高于溶劑對照組，且在2.5～20μmol/L范圍內(nèi)隨處理濃度的增加，彗星率明顯增加，呈顯著劑量依賴關系。進一步對溶劑對照組以及OTA處理組細胞在彗星Tail DNA％、Tail Length及Olive Tail Moment三個指標間的差異進行分析。與溶劑對照組比較，各OTA處理組GES-1細胞的彗星Tail DNA％值

10、均高于溶劑對照組，且隨著OTA濃度升高其值亦相應增加，呈明顯劑量依賴關系。此外，Tail Length以及Olive Tail Moment變化與Tail DNA值變化相一致，均表現(xiàn)為明顯劑量依賴關系。
　　 1.210μmol/L OTA處理不同時間對GES-1細胞DNA的損傷作用：10μmol/LOTA處理6～36 h后，各處理組的彗星率均顯著高于溶劑對照組，且彗星率隨處理時間延長而明顯增高。同時觀察彗星Tail DNA％、

11、Tail Length以及Olive Tail Moment的值發(fā)現(xiàn)均分別高于溶劑對照組，且隨著處理時間的延長上述指標明增加顯著，存在明顯的時間依賴性關系。
　　 2、OTA對Het-1A細胞DNA的損傷作用
　　 2.1不同濃度OTA處理：對Het-1A細胞DNA的損傷作用單細胞凝膠電泳實驗結果顯示，Het-1A細胞經(jīng)不同濃度的OTA處理24h后，各處理組的彗星率均明顯高于溶劑對照組，且隨OTA濃度升高，彗星率也相應增

12、加，呈明顯劑量依賴關系。接下來觀察并分析彗星Tail DNA％、Tail Length及Olive Tail Moment發(fā)現(xiàn)，以上三個指標的值均顯著高于溶劑對照組，且在2.5～20μmol/L范圍內(nèi)，隨著OTA濃度升高而相應增加，呈明顯的劑量依賴關系(Tail DNA％值：r=0.909,P＜0.05; Tail Length:r=0.887,P＜0.05; Olive TailMoment:r=0.995,P＜0.05)2.210μ

13、mol/LOTA處理不同時間對Het-1A細胞DNA的損傷作用10μmol/LOTA處理6～36h后，各處理組的彗星率均顯著高于溶劑對照組，且隨處理時間的延長，彗星率明顯增加，存在明顯時間依賴關系。同時對彗星TailDNA％、Tail Length及OliveTail Moment進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)在6～36h內(nèi)，隨著OTA作用時間的延長，以上三個指標的值均相應增加，呈明顯的時間依賴關系。
　　 3、OTA對GES-1細胞染色體

14、核型的影響
　　 3.1不同濃度OTA對GES-1細胞染色體核型的影響：染色體核型分析表明，2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L OTA分別處理GES-1細胞24h，染色體結構異常和數(shù)目異常的發(fā)生率增加，其中10μmol/LOTA處理組染色體畸變率明顯高于溶劑對照組。
　　 3.210μmol/L OTA處理GES-1細胞染色體核型的影響：10μmol/L OTA分別處理6h、12h、24h及36h，細胞

15、染色體結構異常和數(shù)目異常的發(fā)生率增加，其中12h、24h和36h組染色體畸變率明顯高于溶劑對照組。
　　 4、OTA對Het-1A細胞染色體核型的影響
　　 4.1不同濃度OTA處理Het-1A細胞染色體核型的影響：染色體核型分析結果示，2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L OTA處理后染色體畸變率分別為9.00％、9.00％、10.00％、15.00％，均明顯高于溶劑對照組。
　

16、　 4.210μmol/L OTA處理：不同時間Het-1A細胞染色體核型的影響10μmol/L OTA分別作用Het-1A細胞6h、12h、24h、36h后，細胞染色體結構異常和數(shù)目異常發(fā)生率增加，其中12h、24h和36h組染色體畸變率均較溶劑對照組明顯升高。
　　 5、OTA對GES-1細胞和Het-1A細胞DNA及染色體的損傷的比較
　　 不同濃度(2.5～20μmol/L)、不同時間(6～36h)OTA作用于

17、GES-1細胞和Het-1A細胞后，DNA損傷指標包括彗星的發(fā)生率、Tail DNA％、Tail Length、Olive Tail Moment均明顯增加，OTA誘導的這兩株細胞的DNA損傷無明顯差異。OTA劑量達到10μmol/L方可誘導GES-1細胞的染色體發(fā)生顯著畸變，但OTA劑量為2.5μmol/L和5μmol/L時即能引起Het-1A細胞染色體發(fā)生顯著畸變，提示Het-1A細胞對低濃度OTA較GES-1細胞更為敏感。

18、　　 結論：
　　 1、OTA可以劑量及時間依賴性地誘導GES-1細胞和Het-1A細胞DNA損傷，其彗星率、彗星Tail DNA％、Tail Length、Olive Tail Moment值均較溶劑對照組明顯增高。
　　 2、OTA可以誘導GES-1細胞和Het-1A細胞染色體發(fā)生結構異常（雙著絲粒、斷裂、空隙、環(huán)）和數(shù)目異常（多倍體）。
　　 3、OTA引起的GES-1細胞和Het-1A細胞的DNA損傷情