模擬高原缺氧大鼠腸上皮細胞損傷自噬調(diào)控機制的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:探討模擬高原缺氧大鼠腸上皮細胞自噬變化情況及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路調(diào)控自噬的機制,為進一步研究靶向防治高原相關(guān)腸道疾病提供新的理論依據(jù)。
  方法:以大鼠小腸隱窩上皮細胞(IEC-6)為體外實驗對象,應(yīng)用三氣培養(yǎng)箱模擬高原缺氧(5%O2)構(gòu)建IEC-6細胞缺氧損傷模型為實驗組(Hypoxia),以正常含氧培養(yǎng)箱中的IEC-6細胞作為對照組(Control):(1)MTT法檢測常氧條件下不

2、同濃度的3-MA以及缺氧條件加入篩選出濃度的3-MA(3-MA+Hypoxia)對IEC-6細胞6 h、12 h、24 h、48 h各時間點的毒性作用,以及在對IEC-6細胞6 h、12 h、24 h、48 h各時間點的細胞存活率;(2)應(yīng)用單丹磺酰戊二胺(MDC)染色法、透射電鏡及蛋白免疫印跡(Western blot)法分別檢測缺氧處理IEC-6細胞6 h、12 h、24 h、48 h各時間點自噬體和或自噬溶酶體點狀熒光顆粒、自噬體

3、雙層膜結(jié)構(gòu)及自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達變化;(3)選擇缺氧自噬最明顯時間點加入自噬抑制劑3-MA后,用熒光顯微鏡觀察MDC染色的自噬體和或自噬溶酶體點狀熒光顆粒,透射電鏡觀察自噬體雙層膜結(jié)構(gòu),Western blot法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1以及PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白Akt和磷酸化Akt(p-Akt)的表達變化。
  結(jié)果:(1)3-MA對IEC-6細胞毒性的MTT結(jié)果顯示:隨著3-MA濃

4、度的增加及作用時間的延長,它對IEC-6細胞增殖的抑制率逐漸增強,呈現(xiàn)時間依賴性和濃度依賴性。當3-MA濃度為≤5mmol/L時,對IEC-6細胞增殖的抑制率及藥物毒性較小,選擇5mmol/L為3-MA的實驗濃度;(2)缺氧對IEC-6細胞增殖的MTT結(jié)果:6 h、12 h細胞存活率出現(xiàn)了下降,但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),處理24 h、48 h后細胞存活率明顯下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在缺氧加入自噬抑制劑3-MA同

5、時培養(yǎng)后,從處理12h開始細胞存活率較單純?nèi)毖踅M顯著下降,24 h、48 h下降更明顯,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);(3)MDC染色結(jié)果顯示:常氧組細胞內(nèi)未見明顯自噬體點狀熒光顆粒,從缺氧6h起細胞內(nèi)開始出現(xiàn)點狀熒光顆粒,細胞內(nèi)點狀熒光顆粒大多分部細胞核周圍,在24 h時自噬點狀熒光顆粒達到頂峰,作用48 h后細胞總數(shù)及細胞內(nèi)點狀熒光顆粒開始下降;(4)透射電鏡結(jié)果顯示:缺氧6 h組開始出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體,隨著缺氧時間的延長,

6、雙膜自噬體的數(shù)量逐漸增加,其中以缺氧24 h組自噬體增多最為明顯;缺氧48 h組細胞內(nèi)仍可見大量自噬體囊泡,但細胞結(jié)構(gòu)破壞,細胞核及細胞膜不程度碎裂;(5)Western blot法結(jié)果顯示:缺氧6 h、12 h、24 h、48 h組自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1表達均顯著高于常氧組,48 h后表達有所下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);(6)缺氧加入自噬抑制劑3-MA后,透射電鏡及MDC染色結(jié)果均表明,IEC-6細胞核周圍的

7、自噬體較缺氧組顯著減少;Western blot法檢測結(jié)果顯示,自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1表達較單純?nèi)毖踅M明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);單純?nèi)毖踅M細胞p-Akt蛋白表達水平明顯高于常氧組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),使用自噬抑制劑3-MA后,p-Akt蛋白表達量顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);Akt在缺氧IEC-6細胞損傷后無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
  結(jié)論:(1)模

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