模擬高原缺氧大鼠腸上皮細(xì)胞損傷自噬調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、目的：探討模擬高原缺氧大鼠腸上皮細(xì)胞自噬變化情況及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K)/蛋白激酶B（Akt)信號(hào)通路調(diào)控自噬的機(jī)制，為進(jìn)一步研究靶向防治高原相關(guān)腸道疾病提供新的理論依據(jù)。
　　方法：以大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞（IEC-6）為體外實(shí)驗(yàn)對(duì)象，應(yīng)用三氣培養(yǎng)箱模擬高原缺氧（5％O2）構(gòu)建IEC-6細(xì)胞缺氧損傷模型為實(shí)驗(yàn)組（Hypoxia），以正常含氧培養(yǎng)箱中的IEC-6細(xì)胞作為對(duì)照組（Control）：（1）MTT法檢測(cè)常氧條件下不

2、同濃度的3-MA以及缺氧條件加入篩選出濃度的3-MA（3-MA+Hypoxia）對(duì)IEC-6細(xì)胞6 h、12 h、24 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)的毒性作用，以及在對(duì)IEC-6細(xì)胞6 h、12 h、24 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞存活率；（2）應(yīng)用單丹磺酰戊二胺（MDC）染色法、透射電鏡及蛋白免疫印跡（Western blot）法分別檢測(cè)缺氧處理IEC-6細(xì)胞6 h、12 h、24 h、48 h各時(shí)間點(diǎn)自噬體和或自噬溶酶體點(diǎn)狀熒光顆粒、自噬體

3、雙層膜結(jié)構(gòu)及自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)變化；（3）選擇缺氧自噬最明顯時(shí)間點(diǎn)加入自噬抑制劑3-MA后，用熒光顯微鏡觀察MDC染色的自噬體和或自噬溶酶體點(diǎn)狀熒光顆粒，透射電鏡觀察自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)，Western blot法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1以及PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白Akt和磷酸化Akt（p-Akt）的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：（1）3-MA對(duì)IEC-6細(xì)胞毒性的MTT結(jié)果顯示：隨著3-MA濃

4、度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，它對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的抑制率逐漸增強(qiáng)，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和濃度依賴性。當(dāng)3-MA濃度為≤5mmol/L時(shí)，對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的抑制率及藥物毒性較小，選擇5mmol/L為3-MA的實(shí)驗(yàn)濃度；（2）缺氧對(duì)IEC-6細(xì)胞增殖的MTT結(jié)果：6 h、12 h細(xì)胞存活率出現(xiàn)了下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），處理24 h、48 h后細(xì)胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在缺氧加入自噬抑制劑3-MA同

5、時(shí)培養(yǎng)后，從處理12h開始細(xì)胞存活率較單純?nèi)毖踅M顯著下降，24 h、48 h下降更明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；（3）MDC染色結(jié)果顯示：常氧組細(xì)胞內(nèi)未見明顯自噬體點(diǎn)狀熒光顆粒，從缺氧6h起細(xì)胞內(nèi)開始出現(xiàn)點(diǎn)狀熒光顆粒，細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)狀熒光顆粒大多分部細(xì)胞核周圍，在24 h時(shí)自噬點(diǎn)狀熒光顆粒達(dá)到頂峰，作用48 h后細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞內(nèi)點(diǎn)狀熒光顆粒開始下降；（4）透射電鏡結(jié)果顯示：缺氧6 h組開始出現(xiàn)雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，

6、雙膜自噬體的數(shù)量逐漸增加，其中以缺氧24 h組自噬體增多最為明顯；缺氧48 h組細(xì)胞內(nèi)仍可見大量自噬體囊泡，但細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞核及細(xì)胞膜不程度碎裂；（5）Western blot法結(jié)果顯示：缺氧6 h、12 h、24 h、48 h組自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1表達(dá)均顯著高于常氧組，48 h后表達(dá)有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；（6）缺氧加入自噬抑制劑3-MA后，透射電鏡及MDC染色結(jié)果均表明，IEC-6細(xì)胞核周圍的

7、自噬體較缺氧組顯著減少；Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，自噬相關(guān)蛋白LC3及Beclin-1表達(dá)較單純?nèi)毖踅M明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純?nèi)毖踅M細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯高于常氧組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），使用自噬抑制劑3-MA后，p-Akt蛋白表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Akt在缺氧IEC-6細(xì)胞損傷后無(wú)明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：（1）模