2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)主要侵害3-5周齡雛雞的體液免疫中樞器官-法氏囊的前B淋巴細(xì)胞,引起感染雞的發(fā)病死亡和免疫抑制,并增加了對其他病原的敏感性。目前對于宿主響應(yīng)IBDV感染的分子機(jī)制,尤其是IBDV感染后胞內(nèi)泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin proteasome pathway,UPP)的變化機(jī)制知之甚少。本研究以CEF-16細(xì)胞適應(yīng)毒感染DF-1細(xì)胞為模型

2、,鑒定了病毒編碼蛋白與UPP的共定位并分析了它們的相互作用,并從基因轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯、生物學(xué)活性等不同角度研究了IBDV感染對宿主細(xì)胞UPP的影響,為更好地理解IBDV感染機(jī)制與宿主細(xì)胞的抗病毒策略提供了新線索。
   1.IBDV編碼蛋白與UPP相互作用分析制備了兔抗UPP相關(guān)蛋白E1、UBC9、CHIP、UCHL1、UCHL5、HIP2、Casp3、Casp8、Casp9、p65、p105、IκB、MHCⅠ和MHCⅡ的多克隆抗

3、體,通過建立雙免疫熒光標(biāo)記技術(shù),分析了IBDV感染細(xì)胞中的5種病毒蛋白與UPP中各種重要組分的定位關(guān)系。結(jié)果顯示,在IBDV感染細(xì)胞內(nèi),泛素蛋白或泛素化的蛋白經(jīng)MG132處理后被檢測到在細(xì)胞質(zhì)中呈散點(diǎn)狀分布;IBDV的5種病毒蛋白中,只有VP3蛋白與泛素蛋白以及一種E2蛋白UBC9在細(xì)胞中呈現(xiàn)共定位現(xiàn)象。同時(shí)采用免疫共沉淀的方法驗(yàn)證了上述蛋白之間的相互作用。另外,VP3真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞中上述蛋白之間也存在共定位關(guān)系,進(jìn)一步確定了宿主

4、UPP利用UBC9對病毒VP3蛋白的靶向選擇作用。
   2.IBDV感染對宿主UPP相關(guān)組分轉(zhuǎn)錄本的調(diào)節(jié) IBDV感染DF-1后,應(yīng)用熒光定量RT-PCR技術(shù)分析感染后宿主UPP中27個(gè)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄本的變化。分析顯示,IBDV感染引起了UB、UBI、E1、UBC9、UCHL5、PSMA2、PSMB7、PSMC1、PSMC5、PSMD2、PSMD5、PSME3和PSMF1十三個(gè)基因的上調(diào),同時(shí)CHIP、HIP2、UCHL1和PS

5、ME4四個(gè)基因的下調(diào),PSMA6和PSMB1在病毒感染前后沒有顯著變化;與UPP相關(guān)的介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路NF-κB和caspase通路中p65、p105、IκB、Casp3、Casp8和Casp9六個(gè)關(guān)鍵基因以及MHC抗原遞呈途徑中MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ兩個(gè)組分都在病毒感染后不同時(shí)間點(diǎn)被上調(diào)。隨后,比較研究表明DF-1傳代細(xì)胞和CEF原代細(xì)胞在響應(yīng)病毒感染過程中的轉(zhuǎn)錄本變化趨勢基本保持一致。采用不同毒力的IBDV進(jìn)行比較感染可知,強(qiáng)

6、毒和弱毒IBDV感染引起的UPP轉(zhuǎn)錄本的變化趨勢基本一致,只是在不同時(shí)間點(diǎn)調(diào)控的幅度略有不同,說明進(jìn)化上相關(guān)的病毒誘導(dǎo)了同一種特異的宿主UPP的響應(yīng)模式。進(jìn)一步利用病毒體內(nèi)感染的靶器官也揭示了一種比體外模型上變化更加溫和的響應(yīng)模式,即一些在體外模型上變化顯著的基因如E1、UBC9、PSMB7,PSMC5,PSME3等基因,在體內(nèi)反而沒有發(fā)生顯著變化。另外,通過將表達(dá)VP1、VP2、VP3、VP4和VP5的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞并研

7、究UPP轉(zhuǎn)錄本的變化,揭示了IBDV感染對宿主DF-1細(xì)胞中UPP轉(zhuǎn)錄本的調(diào)控雖然并不是由于某一個(gè)基因單獨(dú)引起的,但是VP3可能在其中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。
   3.IBDV感染對宿主UPP相關(guān)組分蛋白水平的調(diào)節(jié)通過制備的全套抗UPP蛋白的兔多抗,對IBDV感染細(xì)胞中UPP各蛋白的表達(dá)變化進(jìn)行了檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),UPP中的E1、UBC9及CHIP在病毒感染后的表達(dá)量均有所增加;去泛素化酶UCHL1在感染后至24h表達(dá)量最大,此后表

8、達(dá)量有所下降,72h基本不表達(dá),96h和120h又恢復(fù)表達(dá);UCHL5在感染末期才表達(dá);Caspase途徑和MHC途徑中的主要組分的表達(dá)量均出現(xiàn)增加,多數(shù)在感染末期120h達(dá)到最大表達(dá)量。NF-κB途徑中組分在感染前期上調(diào),48h之后基本不表達(dá)。同時(shí)利用以上多抗對IBDV感染細(xì)胞中UPP三種酶蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位,結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒感染引起了E1和UBC9點(diǎn)狀信號的縮小,以及彌散的團(tuán)塊狀信號的出現(xiàn);對CHIP在細(xì)胞內(nèi)的分布和結(jié)構(gòu)特征基本沒有影

9、響,但是陽性信號的細(xì)胞比例嚴(yán)重下降。同時(shí),將表達(dá)VP3的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞并研究了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中UPP各組成蛋白的表達(dá)量的變化后發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染細(xì)胞中UPP中的E1、UBC9、CHIP及去泛素化酶UCHL1和UCHL5在轉(zhuǎn)染細(xì)胞不同生長階段表達(dá)量上下波動,沒有明顯規(guī)律,這提示VP3對宿主DF-1細(xì)胞中UPP的調(diào)控作用可能主要集中在轉(zhuǎn)錄水平,在蛋白水平的調(diào)控可能更多地依賴于多個(gè)因子的共同作用。在分析IBDV感染對宿主蛋白酶體水解活性的影響

10、時(shí)發(fā)現(xiàn),IBDV感染不引起DF-1細(xì)胞中蛋白酶體活性的顯著變化,而蛋白酶體抑制劑MG132無論持續(xù)作用還是僅作用一段時(shí)間都可以顯著地降低蛋白酶體的活性。
   4.阻斷宿主UPP對IBDV感染的影響利用特異性的蛋白酶體抑制劑MG132抑制宿主UPP的降解活性后發(fā)現(xiàn),病毒感染48h以內(nèi)病毒基因的復(fù)制受到嚴(yán)重抑制,但是從48h開始抑制作用逐漸減弱,到96-120h,病毒逐漸恢復(fù)基因復(fù)制能力;從蛋白表達(dá)水平來看,感染后24-72h V

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