慢性腎功能衰竭大鼠主動脈NF-κB活化及泛素-蛋白酶體通路的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景： 心血管并發(fā)癥是終末期腎病患者最主要的致死原因，而尿毒癥加速性動脈粥樣硬化是最受關(guān)注的疾病。目前己明確動脈粥樣硬化實質(zhì)上是血管壁細胞的慢性：損傷炎癥反應，但仍缺乏有效的防治手段。 終末期腎病患者具有嚴重的內(nèi)環(huán)境紊亂，產(chǎn)生了特有的病理生理狀態(tài)和眾多的毒素，如持續(xù)存在異常升高的氧化應激狀態(tài)、各種晚期糖基化和氧化蛋白產(chǎn)物等，同時免疫功能紊亂，加上各種人工替代治療，極易合并感染，這些因素均可直接損傷血管細胞，并且活化血管細

2、胞和免疫炎癥細胞NF-кB這一關(guān)鍵炎癥信號通路，啟動多種炎癥細胞因子、生長因子、黏附分子等基因的表達，誘發(fā)持續(xù)性微炎癥狀態(tài)。這些細胞因子又可進一步誘導NF-кB激活，發(fā)揮正反饋效應，使血管細胞進入損傷一增殖慢性炎癥反應的惡性循環(huán)，促進動脈粥樣硬化病變加速形成。 我們注意到NF-кB是介導炎癥反應的關(guān)鍵信號通路，從理論上講，通過抑制NF-кB激活這一炎癥反應網(wǎng)絡(luò)中的樞紐環(huán)節(jié)，可達到減輕炎癥反應和阻斷血管細胞增殖反應的目的。但是，由

3、于NF-кB信號是炎癥反應的共同通路，長期直接抑制其活性對機體正常免疫防御機能將產(chǎn)生不利影響。近年的研究發(fā)現(xiàn)，泛素-蛋白酶體通路(UPP)與細胞炎癥反應信號轉(zhuǎn)導分子NF-кB的激活、失活等密切相關(guān)，可從多個環(huán)節(jié)參與調(diào)節(jié)NF-кB的激活和再循環(huán)，并且其作用過程中的蛋白酶體成分具有明確的組織特異性，則抑制UPP可從多環(huán)節(jié)抑制NF-кB的活性，并為我們靶向性地針對血管細胞NF-кB活化提供了理論依據(jù)。 目的： 觀察慢性腎功能衰

4、竭大鼠主動脈泛素蛋白酶體組分mRNA和蛋白水平表達變化，以及泛素化蛋白含量、NF-кB活性變化規(guī)律，探討泛素系統(tǒng)活化在慢性腎功能衰竭大鼠動脈炎癥調(diào)控機制中的作用。分析阻斷泛素蛋白酶體信號調(diào)節(jié)途徑對尿毒癥誘導血管細胞炎癥病理變化的影響。為臨床有效防治尿毒癥加速性動脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。 方法： 1、采用部分腎動脈結(jié)扎加腎切除法復制慢性腎功能衰竭大鼠模型，將動物隨機分為單純腎功能衰竭型組(CRY)，腎衰模型+MG-132干

5、預組(CRF+M)，假手術(shù)對照組(CON)。各組大鼠分別于第4、6個月進行血壓、腎功能、血脂等的檢測。 2、應用RT-PCR方法檢測各組大鼠主動脈NF-кB、IкB、Ub、E2的mRNA表達水平。 3、應用免疫組化方法檢測各組大鼠主動脈NF-кB、Ub、TNFα的表達情況，考察這些成分在主動脈內(nèi)表達、分布的改變。 4、應用Western Blot方法檢測各組大鼠主動脈內(nèi)泛素化蛋白的含量，考察慢性腎功能衰竭大鼠主動

6、脈泛素系統(tǒng)的活化情況及MG-132對該系統(tǒng)的作用。 5、應用EMSA方法檢測各組大鼠主動脈內(nèi)NF-кB活化的情況，考察腎功能衰竭大鼠內(nèi)體泛素系統(tǒng)的活化情況及MG-132X寸該系統(tǒng)的作用。 6、應用ELISA方法檢測各組大鼠主動脈及循環(huán)炎癥因子IL1β、TNFα的含量，考察各組大鼠體內(nèi)是否存在微炎癥狀態(tài)及炎癥的程度。 結(jié)果： 1、慢性腎功能衰竭大鼠模型的建立 (1)CON組：血清中肌酐水平正常。(2

7、)CRF組：與CON組比較，血清中肌酐水平顯著升高(p<0.01)，且6個月組較4個月組進一步升高。(3)CRF+M組：與CRF組比較，血清中肌酐水平在術(shù)后4月、6月均略有降低(但p>0.05)。與CON組比較，血清肌酐水平仍顯著升高(4個月組p<0.05，6個月組p<0.01)。MG-132治療可顯著抑制殘腎炎細胞浸潤、腎小球系膜細胞增殖和腎間質(zhì)纖維化，提示泛素系統(tǒng)活化與慢性腎衰竭大鼠進行性腎功能損傷有關(guān)。 2、慢性腎功能衰竭

8、大鼠主動脈UPP組分表達改變及MG-132的作用 (1)CON組：正常大鼠主動脈可見Ub、E2 mRNA及Ub蛋白少量表達，也檢測到泛素化蛋白少量積累。(2)CRF組：與CON組比較，在術(shù)后4月和6月時尿毒癥大鼠主動脈Ub、E2 mRNA及Ub蛋白表達均顯著增加(P<0.05)，泛素化蛋白的累積量未見明顯增加。(3)CRF+M組：與CRF組比較，MG-132治療大鼠主動脈Ub及E2 mRNA及Ub蛋白表達顯著降低，它們的表達水

9、平幾乎與CON組無顯著性差異，但泛素化蛋白的累積量均顯著升高(p<0.01)。提示慢性腎功能衰竭大鼠主動脈內(nèi)泛素系統(tǒng)被顯著激活。 3、慢性腎功能衰竭大鼠主動脈NF-кB組分表達變化及MG-132的作用 (1)CRF組：與CON組比較，在術(shù)后4月和6月時慢性腎功能衰竭大鼠主動脈NF-кB mRNA及蛋白表達均顯著增加(P<0.05)，而IкB mRNA表達卻顯著降低(P<0.05)。NF-кB活性顯著升高(4月時p<0.0

10、1，6月時p<0.05)。(2)CRF+M組：與CRF組比較，MG-132治療組大鼠主動脈NF-кB mRNA及蛋白表達均顯著降低，而IкB mRNA表達顯著性增加，NF-кB的活性明顯下降(P<0.01)。與CON組比較，主動脈NF-кB、NF-кB蛋白表達及NF-кB的活性均無明顯差異，但IкB mRNA表達顯著性上升。提示在慢性腎功能衰竭大鼠，主動脈內(nèi)泛素系統(tǒng)激活與NF-кB活化有關(guān)，抑制蛋白酶體活性可顯著抑制NF-кB通路的活化

11、。 4、慢性腎功能衰竭大鼠主動脈及血液中炎癥細胞因子IL1β、TNFα含量的變化及MG-132的作用 (1)CRF組：與CON組比較，術(shù)后4月及6月慢性腎功能衰竭大鼠主動脈TNFα蛋白含量及血清中IL-1β、TNFα的含量均顯著增高(p<0.01)。(2)CRF+M組：與CRF組比較，MG-132治療組大鼠主動脈TNFα蛋白含量及血清中IL-1β、TNFα的含量均明顯下降(p<0.01)，與CON組比較，無顯著性差異