丹參聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)兔急性心肌梗死后膠原重構(gòu)及心功能的影響.pdf

1、一、兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記
　　 目的：探討體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的方法，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究打下基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：選擇健康日本大耳白兔，取雙側(cè)脛骨行骨髓穿刺，提取動(dòng)物骨髓，采用密度梯度離心法分離提取MSCs，通過(guò)貼壁培養(yǎng)篩選、純化獲得的MSCs，傳代培養(yǎng)。對(duì)MSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，通過(guò)流式細(xì)胞儀，對(duì)CD34、CD29二種表面抗原進(jìn)行鑒定，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs。傳代至第

2、3代時(shí)，加BrdU抗原，免疫組化方法檢測(cè)Brdu標(biāo)記率。
　　 結(jié)果：分離培養(yǎng)48h，貼壁生長(zhǎng)的原代MSCs數(shù)量少，呈長(zhǎng)梭形，8d-10d細(xì)胞集落擴(kuò)大，形態(tài)呈較均一的長(zhǎng)梭形或三角形。達(dá)80％融合時(shí)消化傳代，傳代細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛時(shí)呈旋渦樣。培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，CD34（-）、CD29（+），證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為較純的MSCs。MSCs經(jīng)Brdu孵育后， BrdU體外標(biāo)記率可達(dá)80％。
　　 結(jié)論：應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)方法，可以分離

3、、純化培養(yǎng)兔MSCs，所培養(yǎng)的MSCs體外生長(zhǎng)穩(wěn)定、增殖速度快、貼壁率高、可連續(xù)傳代，可用于MSCs移植治療心肌梗死的進(jìn)一步研究。
　　 二、丹參聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)兔急性心肌梗死后心室膠原基質(zhì)重構(gòu)的影響
　　 目的：觀察丹參聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）移植對(duì)急性心肌梗死模型兔膠原容積和Ⅰ、Ⅲ型膠原比值的影響，探討兩者是否具有協(xié)同治療作用。
　　 方法：取日本大耳白兔2只，穿脛骨骨髓，應(yīng)用貼壁和密度梯度

4、離心法分離、培養(yǎng)MSC，傳至第3代，行BrdU標(biāo)記。10只兔作為正常對(duì)照組，另60只建立急性心肌梗死模型，造模成功后隨機(jī)均分為4組：模型組、丹參組、MSC組、丹參+MSC組。MSC組、丹參+MSC組于造模成功后7d靜脈注射MSC2×106；丹參組、丹參+MSC聯(lián)合組于造模成功后靜脈注射丹參15.4mg/kg，1次/d，共10d。各組于術(shù)后35d光鏡、電鏡觀察心肌組織病理改變；Masson染色及免疫組化測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）、Ⅰ、Ⅲ型

5、膠原比值；夾心酶聯(lián)免疫（ELASA）法檢測(cè)血清MMP-1、TIMP-1及Ⅰ、Ⅲ型膠原水平。
　　 結(jié)果：MSC移植后35dMSC組、聯(lián)合組在梗死及周邊區(qū)存在Brdu顆粒。光鏡下模型組的梗死區(qū)可見(jiàn)大片纖維化區(qū)，梗死及周邊區(qū)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，MSC組的梗死纖維化區(qū)及梗死邊緣區(qū)可見(jiàn)血管增生、炎細(xì)胞浸潤(rùn)。電鏡下梗死模型組、MSCs組的梗死區(qū)可見(jiàn)大量纖維母細(xì)胞增生。與模型組比較，MSC組、MSC+丹參組，血清Ⅰ型膠原顯著增加，Ⅲ型膠原

6、也增加，但各組間無(wú)差異。與模型組比較， MSC組、丹參組、MSC+丹參組血清MMP-1均有所下降，TIMP-1增加，但各組間無(wú)差異。與正常組比較，模型組CVF顯著增加，Ⅰ/Ⅲ顯著下降；與模型組比較，MSC組、丹參組CVF下降，但MSC+丹參聯(lián)合組下降顯著；丹參組Ⅰ/Ⅲ增加，MSC+丹參聯(lián)合組Ⅰ/Ⅲ增加優(yōu)于單純MSC組。
　　 結(jié)論：
　　 1．采用結(jié)扎冠脈前降支的方法可成功建立兔心肌梗死模型。
　　 2．靜脈移植

7、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以遷移至心肌梗死及周圍區(qū)。
　　 3．骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植可通過(guò)改善Ⅰ、Ⅲ型膠原比值使兔急性心肌梗死后膠原重構(gòu)減輕。
　　 4．中藥丹參可以減輕心肌梗死后膠原重構(gòu)，與干細(xì)胞移植聯(lián)合應(yīng)用，效果更顯著。
　　 三、丹參聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)兔急性心肌梗死后心功能的影響及機(jī)制
　　 目的：觀察丹參聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)兔急性心肌梗死后心功能的影響，探討兩者是否具有協(xié)同治療作用，并從炎癥

8、、凋亡角度探討其作用機(jī)制。
　　 方法：取日本大耳白兔2只，穿脛骨骨髓，應(yīng)用貼壁和密度梯度離心法分離、培養(yǎng)MSCs，傳至第3代，行5-溴脫氧核苷尿嘧啶（Brdu）標(biāo)記。正常對(duì)照組10只，另60只建立急性心肌梗死模型，造模成功后隨機(jī)均分為4組，模型組、丹參組、MSC組、丹參+MSC聯(lián)合組。MSC組、丹參+MSCs組于造模成功后第7d靜脈注射MSC2×106；丹參組、丹參+MSC組于造模成功后靜脈注射丹參15.4mg/kg配制成溶液

9、，1次/d，共10d。各組分別于術(shù)后28d行多普勒超聲心動(dòng)圖測(cè)量左室舒張期末內(nèi)徑（LVEDD）、左室短軸縮短率（FS）。術(shù)后35d行病理學(xué)檢查，原位末端標(biāo)記法（TUNEL）檢測(cè)梗死及周圍區(qū)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)；RT-PCR和Western blot法檢測(cè)NF-kb、bcl-2、fas、fasL的表達(dá)。
　　 結(jié)果：與模型組比較，丹參組、干細(xì)胞組和聯(lián)合組左室舒張末內(nèi)徑均明顯縮小，左室短軸縮短率明顯增加，聯(lián)合組變化更顯著，但與干細(xì)胞組比

10、較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，丹參組、干細(xì)胞組和聯(lián)合組凋亡細(xì)胞平均吸光度值明顯下降，聯(lián)合組比單純干細(xì)胞組下降更顯著。PCR與Western檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)：模型組NF-kb、fas、fasL表達(dá)增加，bcl-2表達(dá)下降；干細(xì)胞組、聯(lián)合組NF-KB、fas、fasL表達(dá)下降，且聯(lián)合組下降更顯著；丹參組bcl-2水平增加，而干細(xì)胞及聯(lián)合組未見(jiàn)增加。
　　 結(jié)論：
　　 1．經(jīng)靜脈移植MSC可改善兔急性心肌梗死后心功能。