ERK1-2信號通路調控糖尿病視網膜Muller細胞分泌血管內皮生長因子的作用研究.pdf

1、第一部分:糖尿病大鼠視網膜氧化應激、ERK1/2信號通路激活以及VEGF分泌的研究。
　　目的:研究(1)糖尿病大鼠模型早期視網膜是否出現(xiàn)氧化應激;(2)糖尿病大鼠模型早期視網膜氧化應激是否激活了ERK1/2信號轉導通路;(3)糖尿病視網膜ERK1/2信號轉導通路的激活與視網膜VEGF分泌的相關性;(5)ERK1/2激活在視網膜Muller細胞上的表達。
　　方法:腹腔注射STZ誘導糖尿病大鼠模型,取不同時間點:7天(d)、

2、14天(d)、21天(d)、1月(m)、2月(m)和3月(m)進行各項實驗?；瘜W比色法檢測氧化應激損傷相關指標,包括超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)濃度、丙二醛(MDA)濃度,電鏡觀察不同類型細胞(神經節(jié)細胞、Muller細胞、血管內皮細胞、周細胞、色素上皮細胞)線粒體的超微結構。Western-blot研究ERK1/2信號通路磷酸化激活的變化趨勢。免疫組織化學的方法觀察磷酸化激活的ERK1/2在視網膜中表達的部位。通過

3、EMSA方法研究ERK1/2下游底物AP-1核轉錄因子激活的變化趨勢。Real-time PCR以及Western-blot研究VEGFmRNA和蛋白表達量的變化趨勢。為了觀察氧化應激對ERK1/2信號通路的激活作用,給予藥物rocopherol干預氧化應激,Western-blot方法觀察對視網膜ERK1/2磷酸化蛋白表達影響。
　　結果:氧化應激相關檢查顯示在糖尿病7d時視網膜就出現(xiàn)氧化應激損傷,表現(xiàn)為SOD活性下降、GSH濃

4、度下降、MDA濃度升高。糖尿病2m時表現(xiàn)出更顯著的損傷指標(P<0.05)。電鏡觀察細胞線粒體,DM7d,Muller細胞及神經節(jié)細胞線粒體出現(xiàn)結構異常。Western-blot結果,DM7d時ERK1/2信號通路激活,至2m時達到高峰,期間有上下波動波動。EMSA結果顯示糖尿病成模后AP-1DNA結合活性升高,并且波動趨勢相似于磷酸化的ERK1/2。VEGF結果顯示蛋白及mRNA表達量均升高,波動趨勢相似于磷酸化ERK1/2及AP-1

5、。通過干預氧化應激,ERK1/2磷酸化蛋白表達量下降。免疫組化結果顯示DM7d視網膜內核層出現(xiàn)磷酸化ERK1/2的陽性顆粒,并且在DM2m時表達更為增加。
　　討論:(1)在糖尿病模型極早期視網膜出現(xiàn)了氧化應激損傷,并且神經細胞的損傷早于血管細胞。(2)在糖尿病模型極早期視網膜ERK1/2信號通路激活,VEGF蛋白量及mRNA表達升高,兩者間波動趨勢相似。ERK1/2下游核轉錄因子AP-1的波動也表現(xiàn)出類似趨勢。(3)干預氧化應激

6、能抑制ERK1/2磷酸化激活,提示糖尿病環(huán)境下氧化應激可以激活ERK1/2信號通路。(4)視網膜Muller細胞可能存在ERK1/2信號通路的激活。
　　第二部分:高糖刺激Muller細胞對氧化應激、ERK1/2信號通路及VEGF的分泌影響研究。
　　目的:研究(1)體外培養(yǎng)的Muller細胞在高糖環(huán)境下氧化應激損傷;(2)高糖環(huán)境下Muller細胞是否出現(xiàn)ERK1/2信號通路的激活;(3)高糖環(huán)境下Muller細胞核轉錄因

7、子AP-1是否激活;(4)高糖環(huán)境下Muller細胞VEGF分泌的變化。
　　方法:取新生大鼠視網膜Muller細胞純化培養(yǎng)。傳代后2-3代細胞,高糖(30mM)刺激不同時間:8h、12h、24h、36h、48h,流式細胞儀觀察ROS生成,激光共聚焦顯微鏡觀察線粒體膜電位的下降,電鏡觀察線粒體超微結構。Western-blot方法觀察高糖刺激24h后ERK1/2磷酸化激活的表達量,細胞免疫熒光觀察ERK1/2磷酸化激活的表達。EM

8、SA方法觀察高糖刺激24h后AP-1 DNA探針結合活性。Real-time PCR檢測AP-1的主要組成元件c-Fos和c-Jun mRNA表達量。Real-time PCR檢測高糖刺激8h、12h、24h、36h、48hVEGF mRNA表達量,EIISA檢測高糖刺激8h、12h、24h、36h、48h培液中VEGF濃度。
　　結果:隨高糖刺激時間的不斷延長細胞內ROS逐漸升高,在24h驟升(P<0.05)。高糖刺激24h后細

9、胞線粒體膜電位下降,并且電鏡下線粒體超微結構發(fā)生異常改變。高糖刺激24h后ERK1/2磷酸化蛋白量增加,并且磷酸化ERK1/2表達于細胞核內。高糖刺激24h后Muller細胞內AP-1 DNA結合活性升高,Real-time顯示c-Fos和c-Jun mRNA表達量也升高(P<0.05)。Real-time PCR顯示VEGFmRNA在高糖刺激后升高,并且在24h表現(xiàn)為高峰。ELISA顯示VEGF濃度在高糖刺激后升高,并且在24h表現(xiàn)為

10、高峰(P<0.05)。
　　討論:(1)高糖刺激可致體外培養(yǎng)Muller產生氧化應激損傷;(2)高糖刺激24h,Muller細胞內ERK1/2-AP1信號通路激活;(3)高糖刺激后,Muller細胞分泌VEGF增多,高于正常對照組,而且在24h表現(xiàn)為高峰期。
　　第三部分:分別干預氧化應激及拮抗ERK1/2信號通路對VEGF分泌的作用。
　　目的:研究(1)干預氧化應激對高糖環(huán)境下Muller細胞內ERK1/2信號通路

11、以及VEGF分泌的作用;(2)拮抗ERK1/2信號通路對高糖環(huán)境下Muller細胞VEGF分泌的作用。
　　方法:(1)高糖30mM刺激Muller細胞24h,同時給予抗氧化劑NAC干預(10mM,5mM),Western-blot研究ERK1/2磷酸化蛋白表達,EMSA研究AP-1 DNA結合活性,Real-time PCR及ELISA檢測VEGF mRNA含量及蛋白濃度。(2)高糖30mM刺激Muller細胞同時,給予ERK1

12、/2特異性抑制劑U0126(0.5mM,0.1mM)干預,Western-blot方法研究ERK1/2磷酸化蛋白表達,EMSA方法研究AP-1DNA結合活性,Real-timePCR及ELISA檢測VEGF mRNA含量及蛋白濃度。
　　結果:(1)NAC抗氧化干預后,Western-blot檢測顯示干預組磷酸化ERK1/2蛋白表達量較非干預組下降,并與劑量間存在相關性(P<0.05)。EMSA檢測顯示NAC干預組AP-1滯后條帶

13、灰度值低于非干預組,提示DNA結合活性下降,并與劑量間存在相關性(P<0.05)。ELISA檢測顯示NAC干預組VEGF分泌量較非干預組下降,并與劑量間存在相關性(P<0.05)。Real-time PCR檢測顯示NAC干預組VEGF mRNA較非干預組下降,并與劑量間存在相關性(P<0.05)。(2)U0126干預后Western-blot檢測顯示干預組磷酸化ERK1/2蛋白表達量較非干預組下降,并與劑量間存在相關性(P<0.05)。

14、EMSA檢測顯示U0126干預組AP-1滯后條帶灰度值低于非干預組,提示DNA結合活性下降,并與劑量間存在相關性(P<0.05)。ELISA檢測顯示U0126干預組VEGF分泌量較非干預組下降,并與劑量間存在相關性(P<0.05)。Real-time PCR檢測顯示U0126干預組VEGFmRNA較非干預組下降,并與劑量間存在相關性(P<0.05)。
　　討論:抗氧化應激可下調高糖環(huán)境下Muller細胞ERK1/2信號通路的激活,