惡性血液病中ETV6基因突變的研究.pdf

1、目的:
　　 1.檢測964例初診惡性血液病患者ETV6基因突變的發(fā)生率，并對突變陽性標本進行ETV6基因重排與表達水平的檢測，明確ETV6基因突變與重排及其表達水平是否有相關(guān)性。同時應(yīng)用3D模式圖模擬ETV6突變體對其蛋白結(jié)構(gòu)功能的影響。
　　 2.應(yīng)用芯片一比較基因組雜交(array-CGH)技術(shù)檢測61例初診惡性血液病患者12號染色體短臂(12p)缺失的發(fā)生情況，明確12p缺失對患者臨床及預(yù)后的影響。
　　

2、 3.檢測158例初診急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)患者中免疫球蛋白重鏈(IgH)基因重排的發(fā)生率，并分析其臨床特點及其他細胞遺傳學特征。
　　 方法:
　　 1.收集964例初診惡性血液病患者的骨髓或外周血細胞。利用直接法或短期培養(yǎng)法制備染色體懸液，采用R顯帶進行核型分析。利用DNA抽提試劑盒(Invitrogen公司生產(chǎn))抽提基因組DNA，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增基因組DNA，同時應(yīng)用PCR產(chǎn)物雙向測序的方

3、法分析964例惡性血液病患者ETV6基因突變的發(fā)生情況，采用熒光原位雜交(FISH)技術(shù)及實時熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)分別檢測ETV6基因的重排與表達水平。綜合分析ETV6基因突變與重排及其基因表達水平的關(guān)系，并對突變體所導致的蛋白結(jié)構(gòu)域的改變進行分析。
　　 2.收集61例初診惡性血液病患的者的骨髓或外周血細胞，應(yīng)用利用DNA抽提試劑盒（Invitrogen公司生產(chǎn)）抽提基因組DNA，各自送檢至少1.5mgDNA于上

4、海伯豪生物技術(shù)有限公司，選用安捷倫人類比較基因組芯片(AgilentTechnologies，SantaClara，CA，USA，244K)對61例患者進行array-CGH技術(shù)檢測。同時應(yīng)用送檢公司所提供的軟件(AgilentGenomicWorkbenchLiteEdition6.5software)進行數(shù)據(jù)與圖像的分析，明確12號染色體短臂缺失的發(fā)生情況。
　　 3.選取158例初診B-ALL患者的骨髓標本，應(yīng)用短期培養(yǎng)法

5、制備染色體懸液，采用R顯帶技術(shù)進行核型分析。選用位于14q32IgH基因兩端的序列特異性探針（北京金菩嘉公司生產(chǎn)），應(yīng)用熒光原位雜交技術(shù)(FISH)對158例患者的染色體懸液進行IgH基因重排的檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1.964例惡性血液病患者中ETV6基因突變陽性的共15例，男性7例(n=501，1.4％)，女性8例(n=463，1.7%)，中位年齡為41(17-81)歲。其中急性髓細胞白血病有3例，(AML,n=

6、296，1.01%)，骨髓增生異常綜合征有3例(MDS，n=94,3.19%)，慢性粒細胞白血病急變期有2例(CML-BC，n=69，2.9%)，急性B淋巴細胞白血病有3例(B-ALL，n=139，2.16%)，慢性淋巴細胞白血病有2例(CLL，n=49,4.1%)，急性雜合細胞白血病有1例(MPAL，n=36，2.8%)，慢粒慢性期1例，(CML-CP，n=102,0.98%)而在非霍奇金淋巴瘤(NHL，n=36)、多發(fā)性骨髓瘤(MM

7、，n=28)、急性T淋巴細胞白血病(T-ALL，n=53)及骨髓增殖性疾病中(MPN，n=62)均未發(fā)現(xiàn)ETV6基因突變陽性的標本。3例B-ALL陽性病例中，其中有1例同時伴隨IKZF1基因缺失,4例AML陽性病例中有1例伴隨RUNX1基因突變。突變陽性病例經(jīng)ETV6基因重排檢測結(jié)果均為陰性。通過應(yīng)用RT-PCR技術(shù)對ETV6基因表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)ETV6突變陽性病例與陰性病例之間表達水平無明顯差異。
　　 ETV6基因共8

8、個外顯子，陽性病例中突變位點位于2號外顯子的有1例，位于3號及7號外顯子的各有2例，位于4、5、6號外顯子的各有3例，位于8號外顯子的有1例。在蛋白水平進行分析發(fā)現(xiàn)突變位點主要累及PNT和ETS結(jié)構(gòu)域以及二者的鏈接區(qū)。15例突變陽性病例中9例為移碼突變（移碼缺失2例，移碼插入7例），錯意突變4例，無意突變2例。其中移碼突變及無義突變均可導致蛋白編碼提前終止，產(chǎn)生截短的蛋白，從而影響ETV6基因的功能。
　　 應(yīng)用FISH技術(shù)對7

9、3例伴有12號染色體異常的血液腫瘤患者進行ETV6基因重排的檢測，發(fā)現(xiàn)經(jīng)典重排陽性的有7例(9.6%)，男性3例(3/44;6.8%)，女性4例(4/29;13.8%)，其中AML4例(4/24;16.7%)，ALL2例(2/11;18.2%)，CML-CP1例(1/5;20%)。剩余患者中有12例為ETV6單倍體缺失，6例為部分缺失。結(jié)合染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，7例陽性病例中染色體異常明確累及12p13的有6例，其中t(12;22)(p1