酪氨酸激酶抑制劑對T細胞功能影響的實驗研究.pdf

1、目的:觀察酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor,TKI)舒尼替尼、?？颂婺?、厄洛替尼對人T淋巴細胞的影響。初步探討酪氨酸激酶抑制劑與生物免疫治療聯(lián)合的可行性。
　　方法:應用免疫磁珠分選的方法從外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中分選出T淋巴細胞，分別加入舒尼替尼、?？颂婺?、厄洛替尼培養(yǎng)1小時后，加入PMA刺激T細胞增殖，培養(yǎng)48-72小

2、時后分別收集細胞和細胞培養(yǎng)上清。采用四氮甲唑蘭比色法（MTT法）檢測各組細胞的增殖情況。流式細胞儀測定各組T細胞亞群分布的變化情況，并檢測各組T細胞凋亡和細胞周期的變化。采用ELISA法檢測各組細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β的分泌水平。應用LDH法檢測酪氨酸激酶抑制劑對T細胞特異性殺瘤活性的影響。
　　結(jié)果:1.對T細胞增殖的影響:本研究比較了培養(yǎng)72小時后各組細胞的增殖情況，發(fā)現(xiàn)舒尼替尼、埃

3、克替尼、厄洛替尼均能夠抑制T細胞的增殖，各組抑制率如下:舒尼替尼50ng/ml組為25.6±5.4％(P=0.015)，100ng/ml組為43.2±1.8％(P=0.001)，200ng/ml組為66.0±4.4％(P=0.001);?？颂婺?000ng/ml組為12.0±5.0％（P=0.053），2500ng/ml組為20.0±3.6％(P=0.011)，5000ng/ml組為21.6±5.6％(P=0.022);厄洛替尼500n

4、g/ml組為27.6±2.7％(P=0.003)，1500ng/ml組為35.0±2.0％(P=0.001)，3000ng/ml組為49.1±1.3％(P＜0.001)。2.對T細胞凋亡的影響:采用Annexin-Ⅴ-PI染色法測定各組細胞在培養(yǎng)48小時后的凋亡比例，各組凋亡比例如下:對照組25.2±2.7％，舒尼替尼50ng/ml組24.3±2.9％,100ng/ml組28.7±1.2％,200ng/ml組27.0±3.3％;埃克替尼

5、1000ng/ml組28.4±2.3％，2500ng/ml組28.1±3.3％，5000ng/ml組29.7±2.8％;厄洛替尼500ng/ml組27.6±3.5％，1500ng/ml組25.5±2.3％，3000ng/ml組28.6±2.3％。各實驗組細胞凋亡比例與對照組細胞凋亡比例均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。3.對T細胞周期分布的影響:各組細胞培養(yǎng)72小時后，測定各組細胞的細胞周期分布情況，舒尼替尼、?？颂婺?、厄洛替尼能夠?qū)細

6、胞阻滯在G0/G1期，各組G0/G1期細胞比例如下:對照組:92.87±1.60％，舒尼替尼組:50ng/ml組92.61±1.22％(P=0.83)，100ng/ml組95.43±0.61％(P=0.06)，200ng/ml組96.82±1.09％(P=0.024);埃克替尼組:1000ng/ml組92.00±0.92％(P=0.46)，2500ng/ml組94.07±2.34％(P=0.50)，5000ng/ml組94.75±2.2

7、4％(P=0.30);厄洛替尼組:500ng/ml組94.30±3.14％(P=0.52),1500ng/ml組94.72±1.65％(P=0.235),3000ng/ml組96.05±1.05％(P=0.045)。4.對T細胞亞群的影響:各組細胞培養(yǎng)72小時后測定各組細胞中CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者對CD4+T細胞和CD8+T細胞的比例無明顯影響，與對照組比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，同時發(fā)現(xiàn)舒尼替尼各濃度

8、組均能夠下調(diào)CD4+CD25+CD127-Treg細胞的比例，與對照組比較具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，而?？颂婺峤M和厄洛替尼分別在5000ng/ml、3000ng/ml時實驗組Treg細胞百分比較對照組下降，具有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。5.對細胞因子分泌的影響:培養(yǎng)72小時后，舒尼替尼能夠抑制IFN-γ、IL-2、TGF-β的分泌，對IL-10抑制作用較弱，對IL-4的分泌未產(chǎn)生影響;?？颂婺崾筎GF-β分泌下降，而對IFN-γ

9、、IL-2、IL-4、IL-10均未產(chǎn)生影響;厄洛替尼抑制了IFN-γ、IL-2、TGF-β的分泌，而對IL-4、IL-10未產(chǎn)生影響。6.T細胞殺傷活性的變化:培養(yǎng)72小時后，舒尼替尼、?？颂婺?、厄洛替尼均使T細胞的殺傷活性下降，效靶比40∶1時對照組殺傷率為63.2±8.5％，實驗組各組殺傷率為:舒尼替尼50ng/ml組為45.9±1.2％(P=0.026)，100ng/ml組為18.3±1.4％(P=0.001)，200ng/ml

10、組為4.3±3.9％（P＜0.001）;?？颂婺?000ng/ml組為71.4±7.9％(P=0.289)，2500ng/ml組為49.1±6.4％(P=0.084)，5000ng/ml組為29.4±11.7％（P=0.016）;厄洛替尼組500ng/ml組為30.8±5.6％(P=0.005)，1500ng/ml組為22.3±1.6％(P=0.001)，3000ng/ml組為19.6±9.8％(P=0.004)，效靶比20∶1時對照組

11、殺傷率為39.7±6.2％，實驗組各組殺傷率如下:舒尼替尼50ng/ml組為29.4±9.7％（P=0.195），100ng/ml組為12.1±6.4％(P=0.006)，200ng/ml組為1.4±0.9％(P＜0.001);埃克替尼1000ng/ml組為42.5±7.4％(P=0.646)，2500ng/ml組為11.4±8.1％(P=0.009)，5000ng/ml組為10.4±6.4％(P=0.005);厄洛替尼組500ng/m

12、l組為38.0±6.7％(P=0.755)，1500ng/ml組為17.5±9.4％(P=0.027)，3000ng/ml組為17.5±6.5％(P=0.013)。
　　結(jié)論:酪氨酸激酶抑制劑能夠抑制T細胞的增殖及部分細胞因子的分泌，同時能夠下調(diào)Treg細胞的比例，將細胞阻滯在G0/G1期可能是抑制T細胞增殖的機制之一，酪氨酸激酶抑制劑能夠抑制T細胞的殺傷活性，?？颂婺釋細胞功能的影響要弱于厄洛替尼和舒尼替尼對T細胞功能的影響，